방법 논문

의 성적 개발 및 Ascospore 방전 Fusarium graminearum

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DOI:

10.3791/3895

⸱

2012년 3월 29일

 ,  ,  , 
1Genetics Program, Michigan State University, 2Department of Plant Biology, Michigan State University, 3Human Biology Program, Michigan State University, 4Department of Plant Pathology, Michigan State University

이 논문에서

요약

성 십자가와 재조합 자손의 고립은 사상균에 대한 중요한 연구 도구입니다 Fusarium graminearum, 필요한 기술이 성공적으로 이러한 프로세스에 나타난 수행.

초록

Fusarium graminearum은 filamentous 곰팡이의 개발과 pathogenicity에 공부를 모델 시스템이되었습니다. F.는 graminearum 가장 쉽게 당근 한천에 perithecia라는 fruiting기구를 생산하고 있습니다. Perithecia는 perithecium 개발의 특정 단계에서 생산되는 다양한 조직 유형을 포함합니다. 이들은 (외모 순서) perithecium의 이니셜 (ascogenous 균사를 야기할있는), 외벽, paraphyses (asci 개발까지 perithecium의 중심을 차지하고 멸균 mycelia), asci 및 ascospores 형성 포함 asci 14 이내. 이러한 조직 각각의 개발은 약 24 시간으로 구분되며, 성적 발달 12,8 동안 transcriptomic 연구의 기초가되었습니다. 각 단계의 사진을 포함한 개발의 더욱 철저한 설명을 위해 Hallen 외. (2007)을 참조하십시오. 여기서는 동기를 생성하고 수확을위한 방법을 제시단조는 유전자 조절, 개발 및 생리적 과정의 시간적 연구 perithecia의 잔디를 개발. 이러한 방법은 F. 함께 사용될 구체적으로 작성하고 있지만 graminearum, 기법 fruiting는 문화에 시달릴 수 있도록 제공, 다른 곰팡이의 다양한 사용과 개발에 대한 몇 가지 synchrony가 가능합니다. 우리는 최근 F.의 성적 발달을 연구하기 위해이 프로토콜을 적응했습니다 verticillioides. perithecia을 개발 잔디를 유도하지 못했기 때문에 개별 perithecia는,이 수종에 손을 포착해야하지만, 과정 개발 (Sikhakolli 및 트레일, 게시되지 않은)를 공부를 위해 일했습니다.

곰팡이 fruiting 기관의 가장 중요한 기능은 포자의 분산이다. Ascomycota (자낭은 곰팡이를 생산)의 종의 다양한에서 포자가 통해 (그리고 epiplasmic 유체) 포자의 방출을 유도, 자낭 내에 turgor 압력의 생성으로 인해, 자낭에서 촬영자낭 팁 2,7에서 기공. 강제 ascospore 방전 우리의 연구는 우리가 그 과정에서 변이를 위해 구분할 때 사용하는 "포자 방출 분석"의 개발 결과로했습니다. 여기에서 우리는이 분석의 세부 사항을 제시.

F. graminearum는 homothallic이며, 따라서 호환 파트너의 부재에 fruiting기구를 형성할 수 있습니다. homothallism의 장점은 그 교차로는 고유한 특징이 종 14,7의 성욕 발달의 연구를 촉진하고있다 패싯에 대한 자손의 homozygous를 생성할 필요가 없습니다입니다. 그러나 heterothallic 변종은 5,9를 건너 사용할 수있는 생성되었습니다. 그것은 하나의 변형 1의 몇 가지 유전자에 대한 돌연변이를 얻기 위해 homothallic 변종을 통과하는 것도 가능합니다. 이것은 2 계통 하나의 페트리 접시를 coinoculating 통해 이루어집니다. 미팅 포인트 더불어, perithecia의 대다수는 (부모 변종 중 하나에 돌연변이를 억제 제공하지 않습니다 재조합 될 것입니다) outcrossing. perithecia 시대로서, 그들은 강제로 그들을 배출하는 대신 ascospores 실내 masse을 스며 나오게하다. 결과 포자의 exudate은 (cirrhus 함) perithecium의 일각에 앉아 쉽게 개별적인 포자의 복구를 위해 제거할 수 있습니다. 여기 재조합 perithecia 및 재조합 자손의 회복의 식별을 용이하게하기위한 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

1. Perithecia 생산

  1. F.의 비옥한 변형율과 6.0 cm의 diam 배양 접시에있는 센터 접종 당근 한천 10 graminearum은 (PH-1을 추천).
  2. 장소는 실내 온도 (18-24 ° C)에서 밝은 형광등 아래에서 요리를 주사하고 균사체가 배양 접시 (3-5일)의 바깥쪽 가장자리에 도달하기 전까지는 성장할 수 있습니다. 상업용 가정용 형광등은 fruiting 기관 형성 및 방전을 자극 맞게 설정되어 작동합니다.
  3. 부드럽게 멸균 이쑤시개로 공중 mycelia를 제거합니다.
  4. 멸균 유리 hockeystick 또는 멸균 유리 막대에 둥근 엔드와 표면에 1.0 ML 2.5 % 십대 초반 60 AQ를 배포합니다.
  5. 불빛에 번호판을 반환합니다. 접시에 Parafilm를 추가하지 마십시오.
  6. 24 시간 후, 접시의 표면이 반짝 이는 모습이 있어야합니다. 만약 mycelia 다시 나타납니다, 자국 표면과 다시 신청 십대 초반-60 솔루션입니다.
  7. 다음 주 동안 perithecia 개발을 관찰. 의 중간 단계perithecium 개발은 부드럽게 RNA 추출 (그림 1)에 대한 냉동 한천과 플래시의 표면은 부서에서 수확한 수 있습니다.
  8. 성숙한 포자는 7 일 의한 접시의 뚜껑에 축적됩니다. 처음에는 이러한 것들이 단지 해부 현미경으로 볼 수 있지만, 눈에도 보일 할만큼 일 9 그들은 충분한 농도로 축적됩니다.

2. Ascospore 방전 분석

  1. 일 6 십대 초반 솔루션의 응용 프로그램이 후 나무 보어와 한천의 1cm의 diam 원 그만. 또는 메스는 유사한 크기의 세그먼트를 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 동그라미는 반으​​로 썰어 각각의 절반이 유리 현미경 슬라이드에 둘 수 있습니다.
  2. 동양이 조각 fruiting 기관을 포함하는 표면이 슬라이드의 표면에 직각 수 있도록하고, 포자는 슬라이드의 길이를 아래로 해고되었습니다.
  3. 조명 아래에서 하룻밤 습도 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 포자는 계속 축적됩니다슬라이드와 육안 다음날 아침 (그림 2) 볼 수 있습니다.
  4. 축적된 포자는 물로 씻어 슬라이드 및 원하는 경우 계량 수 있습니다.
  5. 잠재 ascospore 방전 억제제는 분석의 조립시 한천 블록의 뒷면에 추가하여 assayed 수 있습니다. 배출을 줄이고 일부는 이온 채널 억제제는 이전에이 기술을 15 assayed되었습니다.

3. 재조합 자손의 세대

  1. F.의 두 ​​변종과 당근 한천을 inoculating하여 십자가를 개시 graminearum (한 알 + 한 알 -), 배양 접시의 반대편에 접종 포인트를 배치.
  2. 일단 균사가 표면을 가득했습니다 공중 부분을 긁어서하고 위에서 설명한 십대 초반-60 솔루션을 적용합니다. 균사 만나는 배양 접시의 측면에 유의하도록 마커를 사용합니다.
  3. 불빛에 문화를 반환하고 perithecia가 개발한 때까지 알을 품다, 그리고 cirrhi 수있다총이 두 문화 사이의 교차로를 따라 perithecia에서 형성합니다.
  4. 두 문화의 교차로 따라 perithecia을 볼로 해부 현미경에서 가져. 곤충 핀을 이용하여 소독 및 멸균 물에 담근, 핀의 끝부분에 살짝이 테두리를 따라 cirrhus 만지지. 핀에 수분이 cirrhus이 핀에 집착해서는 안된다.
  5. 포자 씻어하기 Eppendorf 튜브에 200 μl 멸균 물 위에 cirrhus로 핀의 팁을 씻어.
  6. 화염 핀, 다시 그것을 축축하게하다 다른 cirrhus를 선택하십시오. 10-15 cirrhi를 선택하고, 물을 별도의 튜브에 각각 배치합니다.
  7. 간단히 와동 튜브는 cirrhi를 일시 중지 포함하는.
  8. 9cm 페트리 접시에 MMTS 매체 1 피펫과 장소와 포자 현탁액의 60 μl를 제거합니다. 멸균 하키 스틱으로 퍼졌다. 나머지 포자 서스펜션은 최대 일주일 동안 4 ° C에 보관하고 필요한 경우 replated 수 있습니다.
  9. Incuba3~5일을위한 실내 온도 (필요하지 빛)에서 테는 아주 작은 식민지는 (그림 3) 나타날 때까지. 식민지 간의 phenotypes 두 종류가있을 것이다. 알 - 식민지는 알 +는 식민지보다 sparser의 균사가됩니다. 재조합 perithecia에서 Cirrhi는 대략 동등한 비율의 두 식민지의 ph​​enotypes을 보여줍니다. 그들을 단지 하나의 표현형의 식민지로 번호판을 폐기하십시오. 때로는 두 개 이상의 phenotypes 다른 요인의 분리로 인해 발생합니다.
  10. V8 또는 저장 당근 한천에 식민지를 이동합니다. 올바른 표현형을 확인하기 위해, Czapek의 Dox 한천 (알 - 변종이 Czapek의 Dox에 성장하지 않습니다)에서와 염소 산염 (알 이상의 변종이 염소 산염과 PDA에 성장하지 않습니다 0.5 M 칼륨 염소 산염)와 PDA에서 테스트 식민지. 원하는 자질에 대해이 식민지를 검사합니다.

4. 대표 결과

perithecia 생산

목표의 잔디가하는 것입니다어떤 mycelia 또는 명백한 포자없이 perithecia. 문화의 표면은 검은색 벨벳 (그림 1)와 유사한 표시됩니다. 24 시간에서 십대 초반의 적용 후 한천의 표면은 약간의 광휘가 있어야합니다. mycelia 다시 표시면 판은 perithecium 개발을 유도 정도 까진되지 않았을 수 있습니다.

Ascospore 방전

항상 야생 형 변형에서 분석 한천의 여러 단위로 제공하고 있습니다. 그 화재하지 않으면, 그때도 당신의 perithecia 너무 어린이나 너무 많은 나이 잖아. 그들은 너무 나이가있다면 여러 균사가 그것을 약간 흰 색조를주는 문화의 표면 위에 나타납니다. 이런 경우가 아닌 경우, 그들은 너무 어려 될 수 있으며, 검정은 24 시간 후에 다시 시도해야합니다. 때때로, 문화가 잘 배출되지 않으며, 실험 반복해야한다. 당신은 적절한 조명 조건 하에서 분석을 수행하십시오.

재조합 자손

재조합 perithecia는 두 변종 사이의 교차로를 따라 perithecia의 대부분을 구성해야합니다. 우리는 보통 십자가에서 10 cirrhi을 처리하고 그 중 최소한 4-6은 재조합해야합니다. 아주 가끔씩, 돌연변이 짝짓기의 변형을 방지합니다. 부모 중 하나가 비정상적 성장 표현형를 가지고있다면, 2 개 이상의 phenotypes는 MMTS의 식민지들 사이에서 존재할 수 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1. 당근 한천에 perithecium 개발의 단계. 십대 초반의 적용 후 왼쪽, 72 H. 붉은 안료와 표면에 검은 알갱이처럼 보이는 매우 젊은 perithecia를 적어 둡니다. 맞아요, 144 H에서 성숙의 perithecia가 형성되고있다. 두 문화의 천박한 mycelia의 거의 완전한 부재를 적어 둡니다.

figure-protocol-2
그림 2. 방전 분석. 주황색 당근 한천 플러그 지향하므로 THA입니다강제 표면 성숙 perithecia에서 배출 t 포자는 유리 슬라이드의 표면에 축적하실 수 있습니다. 15 시간 축적 시간.

figure-protocol-3
그림 3. 알 + 및 선택적 MMTS 매체에서 알 - 식민지 사이에 성장의 차이. 알 - 식민지는 (화살촉) 작은 수 있습니다. 바보 + 식민지는 (화살표) 강력한 성장을 보여줍니다. 사진은 7 일 후에 촬영.

토론

F. graminearum은 특히 잘 주석 게놈 (의 가용성으로 인해 fruiting 기관 개발 연구에 적응되어 mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / 4), 그리고의 가용성 Affymetrix- microarray 6 기반. 이것은 ascospore 방전 7,11,3위한 중요한 유전자를 식별하는 능력을 촉진하고있다. 여기에 제시된 방법은 연구자가 F.의 fruiting 기관의 유전자 분석을 위해 발달 단계와 함수의 이산 집합에 집중할 수있게 graminearum. 메소드는 또한 문화의 열매에 시달릴 수있는 관련 곰팡이에 쉽게 적용할 수 있으며, 다른 곰팡이 fruiting 본문 유형의 다양한 개발을위한 표준으로 사용할 수 있습니다.

포자 발사 표현형을 평가하는 능력은 포자가 볼 작고 어려운 수종 등에 미묘한 수 F. graminearum. 깨끗한 슬라이드에 포자의 컬렉션은 포자가 슬라이드를 씻어하고 quantitated 수 있으므로, 시각 평가와 양적 평가 모두를 용이하게합니다. 일부 곰팡이 종들은 포자와 포자가 떨어져 씻어서 수 없습니다을 둘러싸고 점액을 생산하지만, 그들이 슬라이드에 남아으로 미세하게 계산되어야합니다. 우리는 Sclerotinia sclerotiorum의 사실이 발견되었습니다.

공개 사항

우리는 공개 할게 없다.

감사의 글

이 작품은 국립 과학 재단 (FT에 MCB-0923794)에서 교부금에 의해 지원되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
Fusarium graminearum 변형 PH-1 곰팡이 유전학 증권 센터, 캔자스 FGSC 9075
십대 초반 60 시그마 - 올드 리치 P1629
Czapek의 Dox 한천 Difco, Becton 디킨슨 233,810
칼륨 염소 산염 시그마 - 올드 리치 255,572

참고문헌

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