호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

요약

성인 배꼽 orangeworm의 electrophysiological 응답 (측정하여 빠르게 화면 호스트 식물의 휘발성 물질에 대한 방법 Amyelois transitella) 하나의 구성 요소와 electroantennographic 분석을 통한 조화에 안테나를 시연한다.

초록

식물 휘발성 물질은 식물 곤충의 상호 작용에 중요한 역할을한다. 초식 곤충들은 호스트 공장을 찾습니다 kairomones로 알려진 식물의 휘발성 물질을 사용합니다. ^1,2를 호스트 공장 재배자에 심각한 경제적 손실를 입힐 수있는 해충에 의한 중요한 농경 법의 상품 먹이 손상되면. 따라서 kairomones는 유인하거나 혼동이 곤충을하고, 따라서, 곤충 제어를위한 살충제에 환경 친화적인 대안을 제공하는 attractants으로 사용할 수 있습니다. ³ 불행히도, 식물 생물 기후학 의존 배출량의 다양한 성분과 비율로 광대한 숫자 휘발성 물질을 방출 수 상품 또는 하루의 시간. 이것은 생물학적으로 활성화된 구성 요소 또는 휘발성 컴포넌트 힘든 과정의 조화를 이루고의 신분을 만듭니다. 우리가 실험실 기반의 심사 bioassay의 electroantennography (EAG)를 채용 호스트 식물 휘발성 배출 bioactive 구성 요소를 식별하는 데 도움합니다. EAG는 평가하고 recor 수있는​​ 효과적인 도구입니다D electrophysiologically들은 antennal 수용체를 통해 곤충의 후각 반응. EAG 심사 절차는 유망 bioactive 구성 요소를 식별하는 테스트 휘발성 물질의 수를 줄일 수 있습니다. 그러나 EAG bioassays은 수용체의 활성화에 대한 정보를 제공합니다. 그것은 화합물 elicits 곤충 행동의 유형에 대한 정보를 제공하지 않는다; 행동 반응의 유인, 혐오감 또는 기타 형식으로 될 수 있습니다. 적절한 긍정적인 컨트롤에 대한 상대 EAG에 의해 상당한 반응을 도출하도록 의도 휘발성 물질은 일반적으로 곤충 해충의 행동 반응의 추가 검사로 이동합니다. 실험 디자인을 제시합니다 상세 한 구성 요소 및 bioassay를 EAG 통해 부품의 단순한 조화에 어른 벌레 해충 배꼽 orangeworm (Amyelois transitella)의 electrophysiological antennal 반응의 측정에 의한 ^4,5 아몬드 기반 호스트 식물의 휘발성 물질을 구분할 고용 방법론. 방법은 두 전직을 활용cised 안테나는 "포크"전극 홀더에 걸쳐 배치. 여기서 보여준 프로토콜 심사 휘발성 물질에 대한 신속한 높은 처리량 표준화된 방법을 제공합니다. 자극 수준을 표준화하기 때문에 antennal 응답이 상대적 chemoreceptivity는 지표가 될 수 있도록 각 휘발성이 세트 일정한 금액을 부담합니다. 부정적인 컨트롤 낸 두 잔류 용매 및 기계적 힘을 electrophysiological 응답을 제거하는 데 도움이됩니다. 긍정적인 컨트롤 (이 인스턴스 아세토페논에서) 남성과 여성의 배꼽 orangeworm (NOW) 나방의 일관된 반응을 elicited있다 하나의 화합물이다. 남성하세요 나방과 일관성있는 응답을 제공하고 bioassay 연구에 사용되는 추가 semiochemical 표준 (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, 여성의 생산 성 페로몬에서 알데히드 구성 요소. ^6-8입니다

프로토콜

1. 심사를 EAG에 대한 호스트 공장에서 포착한 휘발성 물질의 작성

1. GC-MS를 통해 모든 휘발성 물질의 적절한 식별 및 인증 후 사용 가능한 각 휘발성의 EAG 퍼프 분석을 수행합니다. 초기 검사 시간이 짧은 금액 (표 1)에 상대 chemoreceptivity의 표시를 달성하기 위해 각각의 섹스를 위해 antennal 반응 낮은 복제 번호 (N = 3-5) 될 수 있습니다.
2. pentane에 5 밀리그램 / ML 농도에서 각 휘발성의 솔루션을 준비합니다. 단단히 (예 : 아세토페논, 밀도 = 1.03 g / ML, 부피 = (0.005 g/1.03 G / ML) × 1,000 = 4.85 1.0 ML 용적 플라스크에 아세토페논의 μL와가 희석 즉시 사용 준비가 될 때까지 샘플을 밀봉하고 냉장 보관 1.0 pentane과 ML).
3. 직전 EAG 분석, 테스트하는 휘발성 물질의 5 밀리그램 / ML 농도를 포함하는 튜브를 제거하고 실내 온도를 따뜻하게 수 있습니다. 한편으로 파스퇴르의 pipettes의 적절한 수를 레이블테스트 각 휘발성와 연관 및 피펫의 팁을 통해 parafilm의 작은 조각 (15 ca. × 15mm)을 싸다. 초기 심사 열 자극 pipettes의 경우 (N은 = 4는 각각 남성과 여성을위한) 불량 준비이나 기타 예상치 못한 장애 발생시로드됩니다.
4. 족집게의 쌍을 사용하여 부드럽게 피펫으로 배치를 용이하게 반으로 bioassay 디스크를 접어 후 부분적으로 CA 있도록 피펫의 큰 끝에 접힌 디스크를 넣으십시오. 디스크의 2~3mm이 노출됩니다. 선반 홀더의 라벨 및 준비 pipettes을 맞춥니다.
5. pipettor이나 주사기를 사용하여, 각 디스크에 휘발성 용액의 10 μL (50 μg)를로드하고 완벽하게 피펫으로 디스크를 삽입하기 전에 합격 2 분 수 있습니다. 일단로드, 즉시 parafilm (15 ca. × 30mm)와 피펫의 끝을 밀봉. 로드되고 숨이 차서되는 휘발성 자극의 양은 대부분 곤충 종에 따라 달라질 수 있습니다.
6. 동일한 프로토콜을 준수하면 위에서 언급한에 컨트롤을 준비각 분석에 포함됩니다. 각 디스크에 단지 pentane의 부정적인 제어 부하 10 μL 들어, 2 분 기다려 표시된 피펫으로로드 및 인감. 긍정적인 제어 들어, 디스크에 10 μL (50 μg)를로드 2 분 기다 라벨 피펫으로로드 및 parafilm과 인감.
7. 곤충 antennal 사립의 생존 능력은 가능성이 가장 높은 수종에 따라 달라질 것이지만, 우리는 Amyelois transitella 안테나는 일반적으로 기술된 프로토콜을 사용하여 절단 후> 30 분 동안 적극적이고 일관성있게 유지 것으로 나타났습니다. 시간이 금액은 일반적으로까지 평가될 수 있도록 4-10 휘발성 시료에 대해있게됩니다. 표 2는 시간과 시퀀스의 예제를 제공합니다.

2. Bioassay를 EAG위한 곤충 안테나의 작성

1. 이 실험의 초점은 분석을 EAG되며, 따라서 각 조사 적절하게 reared 곤충에 액세스할 것이라는 가정합니다.
2. 본 실험에서는 우리는 마셨다 3~4일를 공부한다D, 성관계 남성과 여성의 나방. 개별 나방은 작고, lidded, 플라스틱 용기 분석 당일로 전송됩니다. bioassay로 바로 전에, 테스트되는 나방이 들고기구 (즉, 각종 플라스틱 pipettor 팁 만든)과 뒤에서 담보로 머리를 최초 전송됩니다. 곤충의 조작은 절단을 촉진하기 위해 저전력 스테레오 - 현미경으로 볼 수 있습니다.
3. 안테나 와이어 스쳐 도구를 사용하여 밖으로 조롱하고 있습니다. 전극 젤 작은 영화와 포크 홀더는, 안테나의 빠른 전송을위한 근접 거리에 위치합니다. 첫 번째 안테나는 마이크로 가위를 사용하여 excised과 포크에 배치, 안테나의 기반을 확보하는 것은 포크 (무관심 접지 전극)의 빨간색이 아닌 부분에 위치입니다. 10 분 타이머 세트가 시작되고 두 번째 안테나는 포크의 동일한 측면에 두 기지로 최초의 안테나 옆에 excised과 배치됩니다.
4. 또는 안테나 머무르고 내에서 보안 남아있을 수 있습니다g 튜브는 excised 다음, 부드럽게 관과 끝에 젤의 명인과 함께 와이어 스쳐 도구를 사용하여 곤충 사이에서 제거.
5. 안테나를 기반과 팁은 전극 젤로 포장되어 있습니다 있도록 확인하고 아무런 거품이 젤에 존재하지 않습니다. 엔드 / 팁은 전극 젤에 대한 전체 노출을 보장 줄어들 수 있습니다. 관리는 각 안테나의 나머지가 따라서 퍼프에 노출되는 최대 antennal 표면적을 보장, 젤 덮여되지 않도록하는 데 사용해야합니다.
6. 준비 포크 그런 다음 프로브 프리 앰프에 삽입 200 ML / 기간을 기다리는 십분의 남은 시간을 분에 humidified 공기의 지속적인 흐름 밑에 보관됩니다. 공기 / 퍼프 흐름에게 2-3밀리미터을 지시하도록 조정되는 소비세 시간과 개시 시간을 EAG가 주목된다 (표 2)와 첫 경기 부양 퍼프 이전 삼십초는 긍정적인 컨트롤을 포함하는 피펫은 unsealed와 홀더에 배치됩니다 이 안테나를 준비한.
7. 각 exper 후iment은 테스트 나방은 드라이 아이스 환경에서 euthanized 정상적으로 처리됩니다.
8. 여성 나방은 짝짓기 상태를 확인하기 위해 해부를하고 있습니다. Cohabitating 수컷들이 짝짓기가로 간주됩니다.

3. 개별 구성 요소에 대한 프로토콜을 EAG

1. Antennal 응답 Syntech의 EAG 악기에 포함된 AutoSpike 소프트웨어를 통해 기록됩니다. EAG 프로브와 채널에 대한 AutoSpike 등록 정보 탭에서 구성은 106.7의 샘플링 속도, NO 수습하고, 그리고 0-42 Hz의 필터로 설정됩니다. 필터 탭을 들어, EAG 필터에 있고 낮은 컷오프는 0.1 Hz로 설정됩니다.
2. 자극 퍼프는 기간 1~2초 있습니다. 1 분 설정된 타이머는 각각 낸 후에 시작됩니다.
3. 다음 시험 휘발성 피펫은 unsealed와 홀더에 배치됩니다. 무작위 간의 테스트 휘발성 물질의 순서는 어떤 시험 화합물은 지속적으로 다른 테스트 휘발성을 따라하지 않도록 실행 후 다음됩니다 (예 : 표 2) 조심스럽게 allowi퍼프 사이 NG 일분.
4. EAG 답변을 읽기의 용이성을 촉진하기 위해 통치자의 일부는 컴퓨터 화면에 배치하고 아래 방향으로 편향 신호의 정점에 기본적인 수준은 mm로 측정하고 데이터 시트 (즉, 5 MV 설정을위한, 33mm에 기록된다 = 2.5 MV). 소프트웨어는 향후 분석을 위해 저장 레코딩의 재생 능력을 가지고 있습니다. MV 또는 μV 진폭 중 하나에 mm의 전환은 나중에 데이터 분석에서 수행됩니다.
5. 최종 긍정적인 제어 퍼프가 (예를 들어, 레코드 # 12) 투여 후 안테나가 제거되고 포크는 에탄올 포화 닦아로 세척 및 이후 사용하기 전에 건조 허용됩니다.
6. assays의 처리량을 높이려면 안테나의 다음 세트의 절단은 약 10 분 현재 실험이 끝나기 전에 두 번째 실험실 요원에 의해 시작될 수 - 네 번째 낸 후, 현재 실험의 두 번째 테스트 휘발성, 표에 따라 2. 이것은 구경 할 수 있습니다R 직접 현재의 실험 종료 후 다음 실험의 시작.
7. 복제의 높은 숫자 (다른 안테나에서) 더 통계적 검증을 제공하기 위해 관심있는 화합물을 수행할 수 있습니다.

4. 혼합 또는 기타 매트릭스의 EAG 분석의 예 (표 3)

1. 다음 두 차 조화 (3-컴포넌트 혼합물)에 대한 비율과 볼륨이 높은 EAG 응답 (표 4)을 도출하도록 의도 휘발성 물질을 결합의 예를 제공하기 위해 계산됩니다. 다음 2 phenylethanol과 1시 2분 4초의 두 번째 혼합 비율로 비교 : 2-undecanone : 계산은 기본적인 비율, α-humulene의 1시 1분 1초 어금니 비율을위한 것입니다.
2. 유사한 프로토콜을 사용하여 이전 버전 혼합물의 준비를하고 레이블이 붙은 파스퇴르의 pipettes가 필요한 긍정적이고 부정적인 컨트롤과 함께로드되어 있습니다 설명했다.
3. 휘발성 샘플은 남성과 여성의 안테나를 통해 부풀하고 응답을 측정하고 로그온되어데이터 시트 (표 3).

5. 대표 결과

여성의 배꼽 orangeworm 들어 다음과 같은 설정이 사용됩니다 : 이초 퍼프, 십초 녹화 시간, 10 초간 열리, 5 MV 규모. 부정적인 편향은 전형적인 반응이며, 아직 절대 값 (예 : -3,400 μV 편향은 3400 μV로 기록됩니다) 기록됩니다. 긍정적인 컨트롤에 대한 준비의 비교적 약한 반응은 무시됩니다. 그림 1은 배꼽 orangeworm에 의해 긍정적인 제어 가난한 응답의 그래픽 표현을 제공합니다.

가난한 제어 결과의 예를 들어, 아세토페논으로 평균 여성 antennal 반응은 일반적으로 CA입니다. 2600 μV (그림 2), 준비만이 CA의 응답을 해준다면 말이지. 1300 μV 그것은 폐기 및 안테나 또 한 쌍의가 준비됩니다. 마찬가지로 평균 남성 응답 (Z, Z) -11,13-hexadecadienal는 typicall였다Y 3000 μV은, 따라서, 모든 응답은 이하 1,500보다 μV는 일반적으로 폐기되었다.

각 실험의 시작과 끝에 긍정적인 컨트롤은 또한 안테나의 상태에 관한 정보를 제공합니다. 포스트 컨트롤 (레코드 # 12, 표 2) 퍼프에 antennal 반응은 미리 제어 1 ^{일 퍼프} (레코드 # 1 미만의 75% 하나있다면 우리는 신속한 심사를 위해 다음과 엄지손가락의 규칙입니다 , 표 2) 또는 이전 컨트롤 (레코드 # 2, 표 2) 다음 실험 (그림 3)로 인해 준비 가능한 저하로 데이터 분석에 사용되지 않습니다의 2 ^{차 퍼프보다.} 엄지의 첫 번째 규칙의 예는 기록 # 1이 될 것입니다 = 2,730 μV 및 레코드 # 12 = 1,680 μV, 그리고 엄지의 두 번째 규칙은 만약 이러한 경우 각각에 기록 # 2 = 2350 μV 및 레코드 # 12 = 1,680 μV, , 준비 및 실험의 결과는 폐기됩니다.

와 같은 긍정적인 컨트롤로 측정 EAG 응답 값을 수정 대표 예제는 다음과 같이 될 것입니다.

# 실행	EAG (μV)	# 2를 실행	EAG (μV)	# 3를 실행	EAG (μV)
(+) Ctrl 키를	2800	(+) Ctrl 키를	2420	(+) Ctrl 키를	3030
를 Cmpnd	3000	를 Cmpnd	2500	를 Cmpnd	3440
(-) Ctrl 키를	530	(-) Ctrl 키를	755	(-) Ctrl 키를	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) Ctrl 키를	2770	(+) Ctrl 키를	2400	(+) 클릭률리터	3020

N = 3 실험 위의 값을 사용하여 부정적인 제어 응답이 부정적인 제어가 기계적 퍼프와 용매 잔류에 대한 기준 antennal 반응이다 가정하에 각 실험 내의 모든 값에서 빼는됩니다.

# 1를 실행	EAG (μV)	# 2를 실행	EAG (μV)	# 3를 실행	EAG (μV)
(+) Ctrl 키를	2270	(+) Ctrl 키를	1665	(+) Ctrl 키를	2120
를 Cmpnd	2470	를 Cmpnd	1745	를 Cmpnd	2530
(-) Ctrl 키를	0	(-) Ctrl 키를	0	(-) Ctrl 키를	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) Ctrl 키를	2240	(+) Ctrl 키를	1645	(+) Ctrl 키를	2110

각 실험에 대한 긍정적인 컨트롤이 후 평균 1,000 μV로 정정에 대한 비율을 지적하며, 1,000 μV로 수정됩니다. 데이터 시트 (예, 엑셀)를 쉽게 사용할 데이터에 대한 응답을 변환하는 조작 할 수 있습니다.

# 1를 실행	평균 (μV)	# 2를 실행	평균 (μV)	# 3를 실행	평균 (μV)
(+) Ctrl 키를	2255	(+) Ctrl 키를	1655	(+) Ctrl 키를	2115
(+) Ctrl 키를 형용사.	1000 (0.443)	(+) Ctrl 키를 형용사.	1000 (0.604)	(+) Ctrl 키를 형용사.	1000 (0.473)

각 실험 이내에 보정 비율로 곱한, 화합물의 값이 A와 화합물 B는 그때 조정됩니다.

# 1를 실행	형용사. EAG (μV)	# 2를 실행	형용사. EAG (μV)	# 3를 실행	형용사. EAG (μV)
를 Cmpnd	1094	를 Cmpnd	1054	를 Cmpnd	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

각각의 화합물에 대한 평균 (수단)은 다음엔 평가할 수있다 시험 화합물에 대한 기타 관련 통계 자료 및 EAG 답변과 함께 결정됩니다자세한 조사를 위해 후보입니다.

화합물	EAG (μV)	아니요 실행, N =
	1115	3
B	787	3

그림 1. 안테나 확보 후 가난한 antennal 반응에 의해 삭제됩니다 미리 제어 (1 ^일 양수 제어 퍼프)로 남성 antennal 대응 (1180 μV)의 대표 EAG가 젤로 좋은 연락 있습니다. 아래쪽 창문에 파란색 막대는 휘발성의 이초 퍼프를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

trong> 그림 2.에 여성 antennal 응답 (3400 μV)의 대표 EAG 1 ^일 낸 적절한 간주되는 사전 관리 기능을 제공합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 3. 여성 antennal 가난한 간주되는 포스트 제어에 대한 응답 (1680 μV) (각 실험의 마지막으로 긍정적인 제어) 및 안테나 저하 (<75 1 ^일 사전 통제 % 또는 <의 암시를위한 대표 EAG 사전 통제 제 ^{2 퍼프} 값). 이 예를 들어 1 ^일 이전 제어 퍼프는 사전 통제 퍼프가 2,350 μV였다 2730 μV 및 2 ^{차했습니다.} 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

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그림 4. 후보 휘발성 조화의 퍼프로 여성 antennal 응답 (3800 μV) 및 최대 초기 편향 (3800 μV), 낸 기간 동안 초기 기울기 (의 후속 측정 EAG 대표 0.3 s/1.2 MV = 0.25 S / MV), 나머지 낸 기간 동안 기울기 (1.6 s/1.9 MV = 0.84 S / MV). 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

샘플 매트릭스 및 관련 휘발성 물질을 포함하는 그림 5. 작은 수정 배는 A. 걸쳐 부풀 수 transitella 안테나.

표 1.의에서Autospike 프로그램에 다른과 덜 민감한 구성에 의해 결정 비할 아몬드 (2007)과 EAG 응답 ITU 휘발성 방출.

표 2. 개별 휘발성 컴포넌트에 남성과 여성의 antennal 답변을 녹음 양식의 예.

표 3. 휘발성 혼합 및 / 또는 꽃다발로 남성과 여성의 antennal 답변을 녹음 양식의 예.

표 4. 혼합된 두 가지 비율에 대한 5 MG / ML 솔루션의 10 ML의 준비의 예.

표 5. 2 conse 레코딩을위한 양식의 예남성과 여성 안테나에 걸쳐 하나의 휘발성의 구성 요소 cutive 퍼프.

토론

대상 곤충의 chemoreception 응답을 결정하는 bioassay로 electroantennogram 녹음의 사용은 가스 크로마토 그램 (GC-EAD)의 유출에 대한 감지기로 EAG을 활용한 연구는 문헌에서 찾을 수 흔하다는 다수이다. ^9,10 방법 시연 상대적인 응답의 확신 임무 높은 복제와 휘발성 구성 요소의 상당 금액의 신속한 심사를 제공할 것입니다. 우리가 "심사"값으로 여기서 제시 안테나의 최대 편향 진폭 신호를 (그림 1-3), 제공할 수 있기 때문에 Syntech 소프트웨어의 AutoSpike 프로그램은 심사 휘발성 물질에 대한 좋은 프로그램입니다. 또한 세미 고급 사용에 대한 기타 기본 정보 (그림 4 참조) AutoSpike는 구성 설정과 연구자가 antennal 반응으로부터 나오는 싶어에 따라 함께 얻을 수있다. GcEAD 또는 EagPro Syntech 프로그램은 응용 프로그램입니다결과 흔적이 antenn...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토페논	알파 - Aesar	A12727	여 긍정적인 제어
(Z, Z) -11,13-Hexadecadienal	Suterra		남자 긍정적인 제어
α-Humulene	올드 리치	53,675	Sesquiterpene
2 - Undecanone	올드 리치	U1303	지방산 유도체
2 - Phenylethanol	올드 리치	77,861	Benzenoid
Pentane	EMD	PX0167-1	용제
4 채널 수집 컨트롤러	Syntech	나DAC-4
EAG 프로브, 프리 앰프	Syntech	타입 PRG-2
안테나 홀더	Syntech	PRG-2의 경우	포크 전극
자극 컨트롤러	Syntech	CS-55	공기 흐름과 퍼프
스펙트럼 전극 젤	파커	12-02
Bioassay 디스크	워트 먼지	2017-006	6mm
파스퇴르 pipets	VWR	14673-010	5 잡았다 "(14.6 ㎝)
Parafilm M	Bemis	PM-992