방법 논문

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

DOI:

10.3791/3937

2012년 5월 29일

이 논문에서

요약

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이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 그것은 한 손으로 그리고 다른 한편으로는 태그를 단백질과 두 번째 레이블이 붙은 단백질 (예 : poliovirus) 간의 친화력에 자석 구슬 및 태그 단백질 (예 : nanobodies) 사이의 상호 작용을 기반으로 안정적인 기술입니다.

초록

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이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 한 단백질이 태그를 수 있도록 제공하여 다른 단백질이 라벨이 방법은 단백질 - 단백질 상호 작용 조사하기 위해 구현할 수 있습니다. 그것은 코발트 코팅 자성 구슬에 의해 태그가 단백질의 인식을하고 태그를 단백질과 레이블이 붙은 두 번째 특정 단백질 간의 상호 작용에있는 반면에 손을 대어를 기준으로합니다. 첫째, 라벨 및 태그 단백질을 섞어 실온에서 incubated됩니다. 태그를 인식 자석 구슬은, 추가하고 레이블이 단백질의 바운드 분율은 자석을 사용하여 언바운드 분획에서 분리됩니다. 캡처되는 분류 단백질의 양은 언바운드 분율에 남아 표시된 단백질의 신호를 측정하여 간접적 방법으로 결정될 수있다. conformational 변환 민감한 단백질 엉덩이가되었을 때 설명한 액체 위상 선호도 분석은 매우 유용합니다ayed. 분석의 개발 및 응용 프로그램은 poliovirus 및 nanobodies 1을 인식 poliovirus 간의 상호 작용에 대해 증명하고 있습니다. poliovirus는 단단한 표면 (미발표 결과)에 연결된 conformational 변환 2 ~ 민감한이므로 엘리사의 사용은 제한되며 액상 기반의 시스템은 따라서 선호한다. 자주 polioresearch 3,4에 사용되는 액상 기반 시스템의 예는 마이크로 단백질-immunoprecipitation 시험 5. 이 테스트는 적용을 입증하고있다하더라도, 그것은 6,7 nanobodies에 결석 FC-구조를 필요로합니다. 그러나 또 다른 기회로,이 흥미로운 안정 단일 도메인 항체 8은 쉽게 다른 태그로 조작 할 수 있습니다. 광범위하게 (그의) 6 태그와 같은 자신의 차례에 쉽게 자석 구슬에 코팅 수 니켈이나 코발트와 같은 이가 이온에 대한 친화력을 보여줍 사용됩니다. 따라서 우리는이 간단한 양적 개발친화 캡쳐 분석은 코발트 코팅 자석 구슬을 바탕으로. Poliovirus은 nanobodies과 unhindered 상호 작용을 가능하게하고 정량 검출이 가능하도록 35 S로 분류되었다. 방법은 수행이 용이하고 더 효과적으로 재생 자석 구슬의 가능성에 의해 지원되는 저렴한 비용으로 작성할 수도 있습니다.

프로토콜

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원칙적으로 (A)와 방법에 대한 개요는 (B) 그림 1에 표시됩니다.

1. 버퍼의 작성

  1. 용해 나트륨 dihydrogen 인산 (50 ㎜)과 물에 나트륨 염화물 (300 ㎜)에 의해 워시 / 바인딩 버퍼를 준비하고 8.0로 산도를 조정합니다. 또한 메티오닌 (2 % (M / V) 최종 농도) 및 알부민 십대 초반 20 (0.01 % (M / V) 최종 농도), (0.1 % (M / V) 최종 농도)을 추가하고 필요한 볼륨으로 조정합니다.

2. 마그네틱 비즈의 작성

사용 설명서에 따라 자기 구슬을 준비합니다. 간단히 :

  1. 와동을 사용하여 자기 구슬을 Resuspend.
  2. 양도, 각 샘플에 대해, 튜브로 resuspended 자석 구슬 (40 밀리그램 / ML) 10 μl.
  3. 뜨는가 분명하다 때까지 자석을 사용하여 자기 구슬을 모아서 (+ / - 30 초)과 뜨는을 조심스럽게 제거합니다.
  4. 씻으십시오자석 구슬로 두 번 : 워시 / 바인딩 버퍼 150 μl에 구슬을 resuspend. 자석 구슬 뜨는 분명히 때까지 자석....

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토론

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프로토콜에서 nanobody 상호 작용 항원의 방사능이 뜨는에서 radiolabeled 바이러스의 손실로 정의됩니다. 따라서 시켰던 방사능 (= 100 - %)의 금액은 (자성 비즈에 바인딩) 뜨는 (= %)에서 방사능에 의해 간접적인 방법으로 추정됩니다. 한편 500 MM 이미다졸으로 자기 구슬에서 immunocomplexes를 eluting하여 직접적인 방법으로 항원의 시켰던 바운드 분수의 방사능을 측정하는 것도 가능합니다. 그것은 이전에 방사능의 총량과 뜨는 및 펠렛 분수에있는 방사능의 합계 간의 완벽한 일치가있다는 것을 11을 시연했다. 그러므로 허용하고 뜨는의 방사능을 측정하여 시간을 절약할 수있다. 자석 구슬에서 immunocomplexes의 용출을위한 방법은 Thys 의해 설명되어 있습니다., 2011 11.

APApoliovirus의 RT는 다른 picornaviruses는 경제적으로 중.......

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공개 사항

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우리는 공개 할게 없다.

감사의 글

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저자 방사성 레이블 바이러스의 준비를 위해 제약 생명 공학 및 분자 생물학의학과, 특히 모니크 드 Pelsmacker의 직원을 감사드립니다. 우리는 엘렌 Merckx하고 흥미로운 발언 및 토론을위한 Hadewych Halewyck과 실험실에서 그의 도움을 Gerrit 드 Bleeser에 감사를드립니다. 이 작품은 재정적 Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k Vlaanderen (G.0168.10N)와 세계 보건기구 (TSA 200,410,791)의 OZR의 교부금에 의해 지원되었다. 리자 Schotte는 Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k Vlaanderen (FWO)의 predoctoral 동료입니다.

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재료

이름 회사 소개 카탈로그 번호 코멘트

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dynabeads 그 .. 태그 분리 및 풀다운 Invitrogen 101.03D 자성 구슬
Optiphase 'HiSafe'2 Perkin 엘머 1200-436 섬광 유체

참고문헌

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  1. Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
  2. Meloen, R. H., Briaire, J.

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재인쇄 및 허가

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태그

Liquid Phase Affinity CaptureMagnetic BeadsProtein Protein InteractionPoliovirus NanobodyCobalt Coated BeadsRadio Labeled ProteinsBinding BufferBead RegenerationUnbound Fraction MeasurementSolid Phase Limitation

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