미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

Summary

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

Abstract

TIRF 현미경은 체외에서 형광 분자의 spatio-현세의 역학을 연구하는 강력한 이미징 기술로와 세포에게 ¹ 생활에서 등장했다. 빛이 특성 중요한 각도 (즉 가까이 경계와 평행하게있는 위하여)보다 큰 각도로 낮은 굴절률을 가진 중간에 높은 굴절률을 가진 매체에서 전달했을 때 총 내부 반사의 광학 현상이 발생합니다. 모든 표시등이 같은 상황에서 다시 반사되어 있지만, 지극히 미미한 파도가 만들어지고 그 전체 거리와 함께 기하 급수적으로 붕괴하고, 전용 ^{인터페이스를이} 근처 100-200 nm의있는 샘플 영역을 침투 경계를 따라 전파합니다. 우수 축 해상도를 제공하는 이외에 초점 fluorophores의 밖으로의 감소 여기는 잡음 비율로 매우 높은 신호를 생성하고 ^2,3을 photobleaching의 유해한 영향을 최소화합니다. widefield 기술이기 때문에, TIRF 또한 빠르게 이미지를 교류 할 수 있습니다기반 공촛점 설정을 스캔 가장 이상 quisition.

언뜻 TIRF의 낮은 침투 깊이는 종종 두꺼운 세포 벽에 둘러싸인 세균과 곰팡이 세포의 이미징과 호환되지 않는 것 같습니다. 반대로, 우리는 효모와 박테리아 세포의 세포 벽 실제로 TIRF의 가용성을 개선하고 관찰할 수있는 구조 ^4-8의 범위를 늘릴 것으로 나타났습니다. 많은 세포 과정에 따라서 직접적으로 종종 강력한 유전자 조작 기술을 제공하고 소규모, 단일 셀 미생물에 TIRF 액세스할 수 있습니다. 이것은 우리가 단백질 상호 작용과 활동의 속도론 직접 살아있는 세포에서 평가 수있는 생체내 생화학 실험에서 수행할 수 있습니다.

우리는 여기서 Saccharomyces cerevisiae의 또는 바실러스 subtilis 세포에 대한 고품질의 TIRF 이미지를 얻기 위해 필요한 각 단계를 설명합니다. 우리는 affe 수있는 다양한 문제점을 지적중부 표준시 TIRF 세포의 형광 프로브의 시각화와 여러 응용 예제와 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 TIRF 이미지가 더욱 안정적인 영상 복원 기법을 사용하여 향상시킬 수있는 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 샘플 준비

1. 커버 전표 준비
   TIRF는 coverslip (그림 1A, 영화 1)에서 발생하는 배경 신호에 민감으로 Coverslips는 먼지 입자에서 청소해야합니다.
   1. 뚜껑과 세라믹 홀더에 포셉 장소 커버 전표를 사용.
   2. 1 M NaOH (여러 번 재사 용할 수)와 함께 유리 컨테이너를 채웁니다.
   3. 느린 연속 회전 (궤도 흔드는)에서 2 시인데 위해 품어. 과도한 부화가 (> 8 H) 불투명 커버 전표를 생성합니다.
   4. 느린 연속 회전 미만 5 분 동안 증류수로 두 번 씻는다.
   5. 세라믹 홀더의 상점은 100 % 에탄올로 덮여.
2. 바실러스 subtilis 세포 준비
   
   1. 적절한 성장 미디어의 5 ML에서 0.05 및 지수 상 (0.3-0.7의 OD _600)로 성장 - 0.01의 OD _600으로 희석.
   2. 물 또는 매체에서 1.25 % 아가로 오스를 준비합니다. 배경 형광을 줄이기 위해 합성 미디어를 사용합니다. 95에서 1.5 ML 플라스틱 튜브에 분말을 용해 72시 ° C와 가열 블록의 매장 ° C.

Discussion

TIRF 현미경 이미지 주변 단백질에 대한 선택의 기술입니다. 지극히 미미한 필드의 낮은 침투 깊이 노이즈 비율 매우 좋은 신호로 연결 및 높은 프레임 속도, 또는 아주 약하게 표현 단백질의 영상과 데이터 수집을 허용 초점 광의 밖으로 최소화합니다. 높은 콘트라스트와 높은 프레임 속도의 결합 TIRF 현미경 cortically화된 단백질 이미징 spatio-시간적 역학을위한 완벽한 도구가 있습니다. 흥미롭게도 많은 미생물을 둘러싼 두꺼운 세포 벽이 TIRF에 의해 주변 단백질의 이미징을 방해하지 않습니다. 사실, 지극히 미미한의 실제 생성은 매우 가능성이 세포 벽 및 플라즈마 막 ^5,10 사이의 인터페이스에서 발생합니다. 비상구가 세포에도 ⁸ 효모 세포에서 몇 군데 수있는 넓은 표면적을 설명할 수있는 세포 벽, 함께 빛의 전파으로 이어질 수있는 빛의 반사.

TIRF IM의 최적의 품질에 대한나이는 잘 보정된 현미경 시스템을 가질 중요한 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
도구 / 시약의 이름	유형	회사	카탈로그 번호
궤도 흔드는	도구	UniEquip	UNITWIST 3 차원 로커 흔드는
TIRF 현미경	까지		사용자 정의 설치
유리 용기	도구	Vitlab	340-232880353
세라믹 염색법 걸이	도구	토마스 문화.	8542E40
Concanavalin	시약	시그마	L7647
Coverslips # 1 (18 X 18mm)	현미경	Menzel Gläser	BB018018A1
현미경 슬라이드	현미경	Menzel G레이저	AA00000102E
집중 훈련 오일	현미경	자이스 혈구	Immersol 518F
아가로 오스	시약	Invitrogen	16500-500
FluoSpheres	시약	Invitrogen	F8795