Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

요약

이 연구의 발전을 설명 체외에서 electroporation 기술.

초록

마름모꼴의 입술은 신경 튜브와 넷째 뇌실 ⁽¹ 검토)의 roofplate 사이의 교차점에서 hindbrain에있는 배아 neuroepithelium입니다. 마름모꼴의 입술은 rhombomere 1 (R1)을 포함하고 소뇌의 뉴런의 연결을 다양한 brainstem의 lineages ^2-4로 상승을주는 낮은 마름모꼴의 입술 (LRL)를 생성하는 상위 마름모꼴의 입술 (URL)로 세분화 할 수 있습니다. LRL 파생 상품은 청각 와우각 핵의 뉴런과 균형과 모터 제어 ^5-8를 규제에 관련된 precerebellar 핵 분들을 포함합니다. LRL에서 Neurogenesis은 배아 일 (E) 9.5-16.5 ^{5, 9를} 포함 대용량 시간적 창을 통해 발생합니다. 다른 lineages의 연결이 neurogenic 창을 동안 뚜렷한 발달 일간 postmitotic 세포 (또는 태어난다)로 LRL에서 나온다.

유전자 발현 구조의 Electroporation을하는 데 사용할 수있는LRL progenitors의 유전자 발현을 조작하고 잠재적으로이 지역에서 생산된 ^10-12 뉴런의 운명을 바꿀 수 있습니다. utero의 electroporation의를 통해 마우스의 LRL progenitors의 변화 유전자 발현은 배아 일 E12.5 이상 ^{10, 12-14} 일에 태어 lineages 조작을위한 큰 성공을 거두었습니다. utero의 electroporations에는 사전에 E12.5이 주로 인해 성공하지 못했습니다 보여 주죠는 네 번째 뇌실의 roofplate, LRL로 electroporated되는 외인성 DNA를 제공하는 필요한 단계를 펑쳐링과 관련된. 그러나 많은 LRL 파생된 lineages 일찍 E12.5 ^9보다 LRL에서 발생합니다. 이러한 이전 출생 lineages는 측면 망상을 구성하는 뉴런, 외부 cuneate 및 소뇌 ⁵ 척수와 대뇌 피질로부터 입력을 연결하는 기능 precerebellar 시스템의 열등 olivary 핵을 포함합니다. LRL 표현을 조작하기 위해서는E12.5 미만 배아의, 우리는 배아가 electroporation에 따라 문화에 배치되는 체외 시스템에서 개발.

이 연구 E11.5에서 LRL progenitors의 유전자 발현을 조작을위한 효율적이고 효과적인 방법을 제공합니다. 크게 활성 배속 모터에서 구동 녹색 형광 단백질 (GFP)을 electroporated 태아는 reproducibly 문화 24 시간 후 GFP를 표명했다. 이 분석의 핵심 측면은 유전자 발현에만 때문에 외인성 유전자의 표현이 아니라 인해 이차 효과 변경되는 것입니다 electroporation과 culturing 기법에 따른니다. 그것은 내생 유전자 발현 패턴 electroporated과 교양 배아에 그대로 남아있는 것으로 확인되었다. 이 분석은 overexpression에 대한 plasmids의 도입을 통해 E12.5 미만 배아의 LRL에서 신흥 세포의 운명을 변경하거나 (RNAi를 통해) 아래로 노크를 활용할 수 다른 프로신경 전사 요인.

프로토콜

1. Electroporation 이전 준비

1. 맥시의 준비 (프라임 - 이건 또는 Qiagen)에 의해 electroporation을위한 DNA를 증폭. DNA의 농도는 효율적인 이해 1 밀리그램 / ML 최소이어야합니다.
2. microcentrifuge 튜브 1 X PBS (인산염 식염수 버퍼)의 0.01 % 빠른 그린의 5 μl로 DNA와 혼합 495 μL를 제거합니다.

2. 배아 하베스트

1. CD-1 생쥐 (할란)의 시간이 초과되었습니다 matings을 마련한다. 질 플러그의 존재를 확인하고 질 플러그가 배아 일 (E) 0.5으로 관찰되는 날짜를 생각한다. 태아도 11일 플러그 (E11.5)를 시각화 후에 수확한다.
2. 70 % 에탄올로 소독 도구를 놓습니다. 사용하기 전에 적어도 한 시간 동안 자외선과 판상 흐름 후드를 드셔보세요. 스프레이 후드, 해부 트레이, 그리고 70 % 에탄올로 범위를 해부. 37까지 사전 열 1 X PBS는 ° C.
3. E11.5에서 Institut의 승인 조건에 따라 여성을 안락사시켜야동물의 관리 및 사용 (ICCUA)에 대한 ional위원회. 층류 후드의 해부 트레이를 놓습니다. 70 % 에탄올과 여성의 복부를 스프....

토론

본 연구에서 제시된 시험 관내 electroporation 기술의 효율적 회임 12 일 이내에 젊은 배아에서 유전자 발현을 조작하는 데 활용할 수있는 새로운 방법입니다. 문화에 대한 태아의 위치는 도입 유전자의 표현을 허용하고 electroporated 배아는 생체내에 남아 허용하는 경우 주죠 지켜 circumvents. 이 기술은 electroporation 기반의 연구 이전에 액세스할 수있었습니다 배아 progenitors에서 유전자 발현의 조작을 허용합니다.

배아의 80 %에서 도입 유전자의 효율적인 표현으로 이어지는 electroporation 기술은 분석했다. 으로 electroporated 조직의 범위는 이산 지역에 지역화된입니다 그림 2에서 관찰했다. 특별히 electroporation을 위해 특정 hindbrain 지역을 타겟으로하기 위해서는 전극이의 위치를​​ 이렇게 지배로 신중을 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
그라 이오 스탯	Leica	CM-1850
Biologie 팁 Dumoxel는 뒤몽 포셉을 취급	좋은 과학 도구	11252-30
20mm 모리아 다공 스푼	좋은 과학 도구	10370-17
ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 생성기	BTX (VWR)	47745-928
하버드 장치 7mm Tweezertrodes * 전극	BTX (피셔)	BTX450165
피셔 Isotemp CO 2 인큐베이터	어부	1325525
NAPCO CO 2 가스 조정기	어부	15497020
12 음 조직 배양 플레이트	BD 팔콘 (피셔)	877,229
HyClone 리퀴드 미디어 DMEM/F-12 (1:1), L-글루타민과 HEPES로, 500mL	써모 과학 (피셔)	SH3002301
HyClone * 기증자 말 혈청	써모 과학 (피셔)	SH3007402
Inactivated 태아 소 혈청, 공인, 히트	Invitrogen	16140-063
cellgro * 10,000 IU 페니실린 10,000 μg / ML 스트렙토 마이신	Mediatech (피셔)	MT-30-002-CI
HyClone * L-글루타민, L 글루타민; 200.85 % NaCl에서 0mM	써모 과학 (피셔)	SH3003401
빠른 그린	어부	AC41053-0250	0.01 %