유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포로부터 T lymphocytes의 생성은 T 세포 기반 immunotherapy에 대한 배아 줄기 세포를 사용하는 대체 방식을 제공합니다. 방법 중 하나를 이용하여 알게됩니다 체외에서 또는 생체내에서 유도 시스템, IPS 전지는 종래와 항원에 특정한 모두 T의 lymphocytes로 차별하실 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
항원에 특정한 CD8 + 세포 독성 T의 lymphocytes (CTLs)의 입양 셀 전송 (ACT)는 malignancies 1 다양한 유망한 치료법입니다. CTLs은 악성 세포를 죽이는 T 세포 수용체 (TCR) 및 릴리스 cytotoxins뿐만 아니라 크린 시토킨과 종양 항원을 상호 작용하여 악성 세포를 인식할 수 있습니다. 이러한 CTLs가 높은 proliferative 잠재력을 가지고 있기 때문에 그것은, 덜 차별 및 중앙 메모리 같은 (반응성이 매우 높은 되나) CTLs 행동 기반 immunotherapy에 대한 최적의 인구가있는 것으로 알려져 더욱 차별화된 세포보다 apoptosis에 적은 경향이 있으며이 생체 항상성 크린 시토킨 2-7에 대응하기 위해 높은 능력. 그러나 환자로부터 그런 CTLs의 높은 숫자를 얻기의 어려움으로 인해, 성공적인 ACT 기반 요법에 대한 반응성이 매우 높은 자세 특정 CTLs을 생성하기 위해 새로운 접근 방법을 찾기 위해 긴급 필요가있다.
자체 재생 줄기의 TCR의 형질 도입면역 reconstitution에 대한 세포는 질병 8-10의 치료에 대한 치료 가능성을 가지고 있습니다. 그러나, 환자의 배아 줄기 세포 (ESCs)을 구하는 접근 가능하지 않습니다. 치료 목적으로 조혈 줄기 세포의 사용 (HSCs)가 널리 클리닉 11-13으로 적용되었지만, HSCs는 차별화 및 proliferative 용량을 감소하고, HSCs은 체외의 세포 배양 14-16로의 확장하기가 어렵습니다. 최근 IPS 세포 기술과 유전자 전달을위한 체외 시스템의 개발은 어떤 수술 방법이없는 환자에서 IPS 세포를 생성할 수 있습니다. 또한, ESCs처럼, IPS 세포는 체외에서 무기한 proliferative 용량을 가지고 있고 조혈 세포로 차별화하는 표시되었습니다. 따라서 IPS 세포는 ESCs이나 HSCs에 비해 ACT 기반 immunotherapy에 사용될 수있는 큰 잠재력을 지니고 있습니다.
여기서는 T lympho의 생성을위한 방법을 제시체외에서의 IPS 세포에서 cytes 및 암 면역 감시를 홍보를위한 IPS 세포의 항원에 특정한 CTLs의 생체내 프로그래밍 인치 노치 리간드와 체외에서의 자극은 IPS 세포에서 T 세포 분화를 몰고, 그리고 종양의 성장을 방지 생체내에서 항원에 특정한 T 세포로 차별 IPS 세포의 TCR 유전자 형질 도입 결과. 따라서, 우리는 IPS 세포에서 항원에 특정한 T 세포 분화를 보여줍니다. 우리의 연구는 ACT 기반 요법에 대한 항원에 특정한 CTLs 창출을위한 잠재적으로보다 효율적인 접근 방식을 제공하고 질병에 대한 치료 전략의 개발을 용이하게합니다.
프로토콜
1. 세포 배양
- 문화 (irSNL76 / 7) SNL76 / 7 조사 피더 세포의 준비.
SNL76 / 7 세포는 일반적으로 10% 태아 소 혈청 (FBS) Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM) 매체에 보관됩니다.- 액체 질소에서 SNL76 / 7 세포를 복구하기 전에 30 분 보육, 문화 접시 또는 플라스크는 37에서 0.1 % 젤라틴 용액 ° C로 코팅됩니다.
- SNL76 / 7 세포 confluency 도달하면 세포가 떨어져 trypsinized 5 분 대한 400g에 centrifuged 신선한 매체 resuspended됩니다.
- Resuspended SNL76 / 7 세포는 5,000 래드의 복용으로 60 공동의 irradiator에 반구됩니다.
대체 접근 방식은, SNL76 / 7 세포를 마우스 배아의 섬유아 세포 (MEF)과 mitomycin-불활 성화에 의해 대체될 수있는 것은 방사선을 대체할 수 있습니다. - 조사 후, 전지은 5 분 400g에 centrifuged 것이며로 10% 디메틸 sulfoxide (DMSO) FBS 동결 버퍼 나누어지는에 resuspendedcryovials 및 향후 사용을위한 액체 질소에 보존하고있다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
ACT 기반 요법의 경우 생체내 다시 주입에 대한 반응성이 매우 높은 자세에 특정한 T 세포의 다수의 체외 발생에는 최적의 접근 방식이다. 우리의 체외 방식은 IPS 세포, IPS 세포 파생 세포, 특히 네 번째 주일 만에, 4 주 후에 죽고 다수의 기능성 T 세포의 증가를 제공하더라도. 우리는 노치에서 생존 신호 DL1뿐 아니라 IL-7과 FLt3L은 IPS 세포 파생 전구 T 세포의 생존을 유지하는 데 충분하지 않은가 매개 신호 전달한다는 결론 다른 생존 요인이 세포 성숙을 통제하고 협동있을 수 있습니다. TCR 유전자 형질 도입과 노치 리간드와 시험 관내 자극을 크게 직접적인 T 세포 분화의 IPS 세포 보낸 그러나 IPS 세포 파생 항원에 특정한 T 세포는 여전히 IPS 세포 파생의 적절한 숫자 얻는 것을 방지 더 이상하지 생존, 항원을 수 ACT 기반 immunotherapy에 대해 특정 T 세포.
ve_.......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 제공해 주셔서 박사 신야 야마 나카을 (교토 대학교) 감사 IPS를 MEF-잉-20D-17 세포주, OT1-2A을 지원하기위한 박사 다리오 Vignali (세인트 주드 어린이 연구 병원) • pMig II 만들어낸 박사 후안 카를로스 OP9-DL1 셀 라인을 지원하기위한 Zuniga-Pflucker (면역학학과, 토론토 대학), 그리고 본 연구의 디자인을 도와 주셔서 박사 켄트 전자 Vrana (약리학학과, 의학 펜은 주립 대학교 대학). 이 프로젝트는 국립 암 연구소 Barsumian 신뢰와 흑색증 학술 진흥 재단 (J. 노래)에서 부여 번호 K18CA151798과 보조금 하에서 자금 지원을하고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| C57BL/6J 마우스 | 잭슨 연구소 | 000,664 | |
| B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J | 잭슨 연구소 | 002,216 | |
| 반 (反) 인 경우에는 3 번 CD (2C11) 항체 | BD PharMingen | 553,058 | |
| 안티 CD28 (37.51) 항체 | BD PharMingen | 553,295 | |
| 반 (反) 인 경우에는 3 번 CD (17A2) 항체 | BioLegend | 100,202 | |
| 안티 CD4 (GK1.5) 항체 | BioLegend | 100,417 | |
| 안티 CD8 (53-6.7) 항체 | BioLegend | 100,714 | |
| 안티 CD25 (3C7) 항체 | BioLegend | 101,912 | |
| TI-CD44 (1M7) 항체 | BioLegend | 103,012 | |
| 반 (反) CD117 (2B8) 항체 | BioLegend | 105,812 | |
| 안티 - TCR-β (H57597) 항체 | BioLegend | 109,220 | |
| 안티 - IL-2 (JES6-5H4) 항체 | BioLegend | 503,810 | |
| 안티 IFN-γ (XMG1.2) 항체 | BioLegend | 505,822 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| FBS | HyClone | SH3007.01 | |
| 를 Brefeldin | 시그마 | B7651 | |
| Polybrene | 시그마 | 107,689 | |
| GeneJammer | 통합 과학 | 204,130 | |
| RNA 키트 | Qiagen | 74,104 | |
| DNA 검사 키트 | Qiagen | 69,504 | |
| CD8 절연 키트 | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| ACK 용해 완충액 | Lonza | 10-548E | |
| mFlt-3L | PeproTech | 250 31L | |
| MIL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| 젤라틴 | 시그마 | G9391 | |
| FITC-안티 OVA 항체 | 록클랜드 Immunochemicals | 200-4233 | |
| Permeabilization 버퍼 | Biolegend | 421,002 | |
| BSA | 시그마 | A7906 | |
| 포름 알데히드 | 시그마 | F8775 | |
| 0.4 μm의 필터 | MIllipore | ||
| Moflo 세포 분류기 | 타케의 Cytomation | ||
| Calibur 흐름 Cytometer | BD | ||
| LSR II 흐름 Cytometer | BD | ||
| 마우스 restrainer | Braintree 과학 |
참고문헌
- Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Se....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
