우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Pluripotency과 자기 갱신은 배아 줄기 세포의 두 정의 특성 (ES 세포)입니다. 기본적인 분자 메커니즘을 이해하는 것은 크게 발달 생물학 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의료 (1,2 년 검토)의 ES 세포의 사용을 촉진합니다.
ES 세포 유지 및 자기 갱신의 소설 규제의 식별 및 특성을 신속하게하기 위해 우리는 양적 Oct4GiP 세포에게 3을 사용 마우스 ES 세포의 자기 갱신 상태를 측정하는 형광 리포터 기반의 분석을 개발했습니다. Oct4GiP 전지는 4,5 Oct4 유전자 프로 모터 영역의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현. Oct4는 차별 6,7 중에 ES 세포 자기 갱신이 필요합니다, 그리고 고도의 ES 세포에 표현되며, 빠르게 아래쪽 규제. 그 결과, 기자 세포에서 GFP 발현과 형광 성실하게 상호ES 세포 정체성 5 및 형광 - 활성 셀 정렬과 (FACS) 분석 밀접하게 단세포 레벨 3,8에서 세포의 자기 갱신 상태를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
RNAi와 결합, Oct4GiP 기자 분석은 신속 ES 세포 유지 및 자기 갱신 3,8의 규제를 파악하고 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 자기 갱신을 시금위한 다른 방법과 비교했을 때, 그것은 더 편리하고 민감한, 양적, 그리고 낮은 비용입니다. 이러한 높은 처리량 화면 또는 유전자 epistasis 분석과 같은 대규모 연구 또는 접시 384 - 잘 - 그것은 96에 실시 할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 혈통 특정 기자의 ES 세포 라인을 사용하여, 우리가 여기서 설명하는 분석도 ES 세포 분화 동안 운명 사양을 공부하고 수정할 수 있습니다.
프로토콜
1. Oct4GiP 마우스 ES 세포 유지 보수
Oct4GiP 전지는 친절 박사 오스틴 스미스에 의해 제공되었다. 그들은 Oct4-GFPiresPac transgene 4,5 들고 129/Ola 마우스에서 파생되었다. 그들은 ESGRO 전체 더하기 clonal 학년 중간 (Millipore), 또는 M15 매체의 젤라틴 코팅 조직 배양 플레이트에 유지됩니다 DMEM (Invitrogen)은 15% FBS, 1000 U / ML ESGRO (Millipore), 1X 비로 보충 필수 아미노산 (Invitrogen), 1X EmbryoMax Nucleasides (Millipore) 및 10 μm의 β-메르 캅 토 에탄올.
- 30 분간 실온에서 0.1 % 젤라틴 (시그마) (0.1 ML 젤라틴 용액 / cm 2)와 코트 판.
- 플레이트 Oct4GiP의 ~ 2시 젤라틴 코팅 접시에있는 세포 × 10 4 / cm 2.
- 0.05 %의 트립신과 함께 이틀 세포를 분할.
2. Oct4GiP 셀에서 siRNA의 Transfection
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토론
우리가 위에서 설명 Oct4GiP 기자 분석은 정량적 자기 갱신 대 분화의 정도를 측정할 수 있습니다. 이러한 형태학 기반의 12 확산 / assays 생존 기반과 같은 다른 가능한 방법, 비교, 그것은 높은 감도 및 처리량뿐만 아니라 ES 세포 상태의 더 직접적인 측정을 제공합니다. 그것은 따라서 잘 대형 스크린 및 유전자 epistasis 분석에 적합합니다. 실제로, 우리는 다른 사람이 성공적으로 게놈 전체의 RNAi 화면 3,8에 대한 Oct4GiP 기자 분석을 사용 하였다. 모든 assays처럼, 그러나 그것은 또한 제한 사항이 있습니다. 그것은 직접 또는 간접적으로 Oct4 프로 모터의 활동을 조절하는 유전자를 공부하고 그것이 거짓으로 사후 transcriptionally GFP 발현, 안정성, 또는 기능에 영향을 미치는 유전자를 식별할 수 사용될 수 있습니다. 따라서 추가적인 assays 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 염색법 13 (Millipore,.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 읽고 원고를 편집 브래드 Lackford 감사드립니다. 이 연구는 환경 건강 과학, 건강 교내 연구 프로그램 Z01ES102745 국립 연구소 (GH까지)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| ESGRO 완전한 플러스 clonal 등급 매체 | Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (높은 포도당 1X) | Invitrogen | 11,965 | |
| 0.25 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | Invitrogen | 25,200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1,001,817 | |
| OPTI-MEM (혈청 매체를 줄이기) | Invitrogen | 31,985 | |
| ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (비 필수 아미노산) | Invitrogen | 11,140 | |
| ES 세포에 대한 100x Nucleosides | Millipore | 10620-1 | |
| 2 - 메르 캅 토 에탄올 | 시그마 | M7522-100ml | |
| ES-자격 태아 소 혈청 | Invitrogen | 10,437 | |
| Nanog의 siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2의 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
제어 siRNA : Dharamcon에 의해 합성 반딧불 루시페라제을 (5'-CGTACGCGGAATACTTCGA) 대상으로 siRNA의 이중.
참고문헌
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: l....
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재인쇄 및 허가
