방법 논문

α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거

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DOI:

10.3791/3999

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2012년 5월 16일

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1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

이 논문에서

요약

CD4 열거 방법, α-테스트는 신속하고 정확한 CD4 카운트를 제공하기 위해 전체 타액을 사용하는 설명되어 있습니다. α-테스트 비용 동전과 같은 단클론 항체, 계측, 냉동, 샘플 운송뿐만 아니라 수집 및 혈액의 처리와 같은 기술 교육, 값비싼 시약의 필요성을 없애줍니다.

초록

HIV 질환을 모니터링하기 위해 저렴한 CD4 열거를위한 긴급 필요가있다. CD4 열거는 혈액 세포, 오직 현재 결제 방법에 대한 CD4를 측정하기위한 특정 단클론 항체의 시간 및 온도 제한, 기술 세련미와 시약 비용으로 인해 자원이 제한된 지역에 범위 밖입니다. 일반적으로 사용되는 비용 절감 및 시간 절약 실험실 전략은 오히려 측정 특정 혈액 값보다 계산하는 것입니다. 예를 들어, LDL 수치는 총 콜레스테롤, HDL 및 트리 글리세 리드가 1 측정된 수준을 사용하여 계산됩니다. 따라서 직접 CD4의 개수 + T 세포는 CD4을 계산하는 정확한 방법을 제공할 수를 조절 세포가없는 상호의 신분은 상호의 생리 관련으로 인해 계산됩니다.

혈액을 입력하고 CD4에게 + T 세포를 순환이되도록 운명되는 줄기 세포의 수는 케모카인 CXCL12에 의해 결정됩니다ND는 수용체는 운동 2 자신의 영향력으로 인해 CXCR4. 혈액으로 줄기 세포 운동의 과정은 또한 세포 표면에 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE CS) 및 HLE CS-반응성 활성 α 1 proteinase 억제제 (α 한 PI, α 1 antitrypsin, SerpinA1) 3에 의해 규제됩니다. HIV-1 질환에서 α 한 PI는 질병 프로세스 4 ~ 인해 inactivated있다. HIV-1 질병의 조기 asymptomatic 카테고리에서 활성 α 한 PI는 치료 HIV-1 환자 (평균 = 12 μm의, 그리고 증상 범주 4, 5 중 정상적인 수준을 달성하는 100 % 아래 정상적인 것으로 발견되었다.이 패턴이 아닌 부족한 합성, proteolytic 불활 성화 또는 산소로, 면역 불활 성화에 기인되었습니다. 우리는> 220 CD4 세포 / μl와 HIV-1 과목에서 CD4 카운트가 (R 2 개 활성 α 한 PI의 혈청 수준과 상호 것으로 관찰 = 0.93, P &그건, 0.0001, N = 26) 및 비활성 α 한 PI (R 2 = 0.91, P <0.0001, N = 26) 5. HIV-1 감염과 감염되지 않은 과목에 대한 α 1 PI의 행정은 α 한 PI는 CD4의 수를 규제에 참여 + T 세포가 혈액 3에서 제안 CD4 카운트 극적으로 증가 결과.

자극을 통해 전체 타액 활성 α 한 사설 탐정이 측정의 상관 관계의 측정 그것이 CD4 카운트를 계산하는 정확한 방법이라는 증거입니다 있도록 충분한 묽은 exudate을 (플라즈마가 타액으로 혈관 벽을 통과 proteinaceous 재료를 포함)가 포함되어 있습니다. 간단히 같은 껌이나 구연산 등의 산성 sialogogues은 전체 입을 타액으로 혈청 스며 나옴을 자극. 혈청 스며 나옴을 자극 후 타액의 혈청 α 한 PI의 활동 엘라스타제 활동을 억제하기위한 능력에 의해 측정됩니다. 돼지의 췌장 엘라스타제 (PPE)엘라스타제의 즉시 사용할 수 저렴한 소스입니다. PPE는 특정 기판, colorimetric 펩타이드입니다 중 하나, succinyl, L 살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide (SA를 cleaving에서 PPE을 방지 일대일 복잡한을 형성 α 한 PI에 바인딩 3 NA). 상온에서 10 분 용 보호구의 포화 농도와 타액을 잠복기 것은 타액에있는 모든 활성 α 한 PI에 PPE의 바인딩이 가능합니다. 활성 α 한 PI에 의해 PPE의 결과 억제는 PPE 기판 SA 3 NA합니다. (그림 1)를 추가하여 측정할 수 있습니다. CD4 카운트는 혈액 부피 (CD4 세포 / μl)의 측면에서 측정하고 있지만, 타액의 α 1 PI의 농도는 볼륨이 날짜와 사람 중에 상당히 달라질 수없는 타액의 볼륨 때문에, 타액의 혈청 농도와 관련되어 사람 6. 그러나, 타액의 거의 모든 단백질은 혈청 컨텐츠로 인해이며, 타액의 단백질 함량은 내 잘못이다7 surable. 따라서 타액에서 활동중인 α 한 PI는 타액 단백질 콘텐츠에 대한 비율로 계산되며, α 1 PI 인덱스 되나있다. 결과는 본 α 한 PI 지수는 CD4 카운트를 계산하기위한 정확하고 정밀한 physiologic 방법을 제공하는 입증 제시.

프로토콜

1. 신선한 워킹 솔루션을 준비한다

  1. TBS : 0.05 M 트리스는 식염, 산도에게 7.8 (TBS)을 버퍼. 60 ML TBS / microplate를 준비합니다.
  2. PPE : 돼지의 췌장의 엘라스타제, 유형 1 (PPE) 정학로 제공됩니다. 잘 흔들 약 0.01 U / ML에 TBS에서 PPE를 희석. 6 ML)이 솔루션 / microplate 일을 준비합니다.
  3. SA 3 NA : Succinyl, L 살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide (SA 세 없음). 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 0.1 M 주식 SA 3 NA 솔루션을 준비하고 -20 ° C. 즉시 사용하거나 저장 주식 SA 3 NA 솔루션 TBS에서 100분의 1을 diluting하여 6ml 작업 솔루션 / microplate를 준비합니다.
  4. COOMASSIE 블루 : TBS에서 10 % Coomassie 브릴리언트 블루 R-250 (Coomassie 파랑)의 주식 솔루션을 준비하고 -20 ° C. 즉시 또는 상점 사용 TBS 주식 솔루션 1천분의 1을 diluting하여 6 ML 작업 솔루션을 준비합니다.

2. 타액을 준비

  1. 침이 컬렉션 서있는 위치에서, 같은 입안에 구연산 산성이나 껌 같은 sialogogue을 배치하여 타액으로 혈청 스며 나옴을 자극. 무설탕 레몬 드롭 자주 edentulous와 껌을 씹을 수없는 HIV-1 환자 편리합니다. 처음 3 분 동안 필요에 따라 삼키는하고, 다음 3 분위한 덮힌 컵에 전체 입을 타액을 수집합니다. 이것은 타액의 약 2 ML을 제공합니다. -80시 즉시 사용하거나 저장 ° C.
  2. 타액 처리 :면 37 ° C와 얼음 장소에 냉동, 해동의 표본. 2-4에서 신선한 또는 해동 표본을 저장 ° C ~ 삼일 이상 더 이상은 아니야. 와동하지 타액 수행되며 혈청 exudate를 포함하지 mucin을 pipetting하지 마십시오. 침이 취급시주의 사항 표준을 사용 http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf를 .

3. Microplate 설정까지

  1. 버퍼 : 측정은 세중의로 진행됩니다. microtiter 접시의 각도에 130 μL TBS에 추가됩니다.
  2. 표본 : 각 시험에 잘, 150 μl / 우물의 최종 부피 20 μL 타액이 추가됩니다. 거품을 도입하지 않고 pipetting하여 섞는다.
  3. 제어 : 긍정적인 컨트롤 PPE를 포함하지만 아무 타액. 부정적인 컨트롤은 타액을 포함하지만 아무 PPE.To는 긍정적인 컨트롤이 그래요, 20 μL TBS를 추가하지 않습니다. 부정적인 컨트롤 그래요, 20 μL 타액에 추가됩니다.
  4. PPE 보육 : PPE 작업 솔루션을 잘 흔들어. 물론 부정적인 제어 우물 제외한 각 50 μL PPE 작동 솔루션을 추가합니다. 부정적인 제어 우물로, 50 μL TBS를 추가합니다. 23 ° C.에 10 분 알을 품다
  5. 기판 보육 : 각 잘 ~ 50 μL SA 3 NA 작업 솔루션을 추가합니다. 23 ° C.에 45 분 품어
  6. COOMASSIE 블루 :. 50 μL Coomassie 파랑 작업 솔루션을 추가
  7. - 읽기 : microplate 리더의 흡광도, 활성 α 한 PI 및 단백질 함량을 나타내는 Coomassie 파랑을 감지하기 위해 595 nm의를 대표하는 SA 3 NA 절단을 감지하기 위해 405 nm의를 참조하십시오.

4. α 1 PI 지수를 계산

  1. 평균 405 nm의 및 595 nm의을 정상화 : 각 세중의 경우, 평균을 계산합니다. 표본 평균에서 제외 제어 평균을 뺍니다. 플레이트 - 투 - 플레이트 편차를 최소화하려면 다음과 같이 긍정적인 제어 평균하여 각 표본 평균을 나누어 평균을 정상화 :

figure-protocol-1

  1. α 1 PI INEX를 계산 : 표준 595 nm의 의한 405 nm의 정규 나누기 :

figure-protocol-2

5. 대표 결과

지방병, 리소스 제한된 지역에서 CD4 카운트를 모니터링하는 시점의 케어 선별 검사로 α-테스트 용도 적합 여부를 확인하려면 자극 타액 20 여성에서 수집되었다 11 남성의 HIV-1 과목 참석 클리닉에 대해 카메룬의 일상적인 관리. 뉴욕시에서 수집된 타액을 사용하는 α-시험 개발하는 동안 예비 관찰과 일치, 타액의 α 1 PI 지수는 CD4 카운트 (R 2 = 0.91, P <0.0001. N = 31)와 상호 카메룬에서 수집했습니다. 관계는 선량 - 반응 관계 (그림 2A)과 일치 3 - 매개 변수 sigmoidal 곡선에 의해 정의되었다. 95 %의 신뢰와 예측 간격이 각각 파란색과 빨간색 선, (그림 2B)로 표시됩니다.

에이전의 연구, 우리는 CD4 + T 세포는 주기성 23 sinusoidal 사이클링 ± HIV-1 과목과 α 1 PI 결핍증 (PIZZ) 3 상속된 버전 과목 3.5 일 전시 사실을 확인했습니다. 묘사 본 27 일간의 주기성 (그림 3A)를 전시가 아닌 HIV-1 건강한 통제 사이클링 CD4의 컴퓨터가 만든 사인 곡선 분석의 대표적인 예입니다.

CD4의 컴퓨터가 만든 사인 곡선 분석 + 6 과목 T 세포 변화는 진동 3의 피크 - 투 - 피크 진폭 및 축에 대한 가치관이 나왔고. 예상되어지는대로 진동 축이 진폭 (R 2 = 0.96, P = 0.009, N = 6) (그림 3B)와 상호되었습니다. 환자 것입 낮은 CD4 T + 셀 카운트는 CD4 T 세포 카운트의 주기적 변화가 작았, 높은 CD4 + T 세포 카운트 환자에서 주기적 변화가 큰 있었다.

때문에그림 2에 묘사된 회귀 선 진동과 진동 축 축이 진폭이에 의해 변경할함으로써 회귀 선 CD4 + T 세포가 예상되어지는 얼마만큼 위 아래 추정 회귀 선에 대해 계산할 수, 진폭과 서로 관련되어 추정 사이클링 (그림 3C). 그림 3C와 그림 2B에서 계산된 신뢰 구간 계산 진폭 오버레이, 그것은 진폭이 (녹색 라인) 95% 내에 놓여 것으로 나타났다 신뢰 구간 (파란색 선) (그림 3D).

figure-protocol-3
1 그림. 절차 요약 : 입안에 장소 구연산 산성과 타액을 수집합니다. 세중의에 microplate의 우물로 희석 타액을 추가합니다. 각도에 PPE를 추가하고 23 ° C.에 15 분 동안 품어 각도에 PPE 기판을 추가하고 23 ° C에서 45 분 동안 품어. Coomassie 블루를 추가하고 PPE 활동을 감지하고 595 nm의에서 단백질을 감지하는 405 nm의에서 읽어보세요.

figure-protocol-4
그림 2. 표준 CD4 열거 방식으로 α-테스트의 비교. ) α-시험이 자극된 전체 입을 타액에서 α 한 PI 지수를 quantitating에 의해 수행되었다. CD4 카운트는 표준 유동세포계측법를 사용하는 독립 의학 연구소에 의해 수행되었다. 유동세포계측법과 타액을위한 혈액은 같은 병원 방문에서 수집된되었다. α 1 PI 지수와 CD4 카운트 사이의 관계는 3-파라미터 sigmoidal 곡선 (R 2 = 0.91, P <0.0001, N = 31). B) 95 %의 신뢰와 예측 간격은 파란색과 빨간색으로 그려져있다 정의한 각각 선,.

figure-protocol-5
그림 3. CD4에게 C를 계산의 정확성α1PI Index.A를 사용 ounts)은 CD4 + T 세포가 아닌 HIV-1 건강 관리 27 일간의 주기성으로 sinusoidal 자전거를 전시. 진동 축이 그려져있다 (빨간 점선). B) T 세포 사이클이 4 HIV-1 과목 진동 피크 - 투 - 피크 진폭과 축을 계산하는 데 사용되었다 CD4, 1 이외의 HIV의 컴퓨터 생성된 사인 웨이브 분석 -1 PIzz 제목과 부품 A에서 CD4 간의 관계를 묘사되지 않은 HIV-1 건강 관리 T + 세포 진폭과 진동 축 3 - 매개 변수 sigmoidal 곡선 (R 2 = 0.96, P = 0.009, N에 의해 정의되었다 = 6). C) 부분 B)에서 파생되는 진동의 진폭과 축 사이의 sigmoidal 관계는 그림 2에서 회귀 선 (검은 선)을 따라 포인트의 예상 진폭 (녹색 라인)을 계산하는 데 사용되었다. D) 예상 진폭 간격 (녹색 라인)는 95 % 신뢰 구간 (에서 크게 달랐다로 맨 휘트니 순위 합 시험과 진폭 선과 회귀 선 (37 세포 사이의 평균 차이 (95 % 신뢰 구간과 회귀 선 (63 셀 / μl 사이의 평균 차이 비교 기준)에 따라 결정 파란색 라인) / μl), P = 0.001).

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토론

Undiluted 혈청은 평균 36 μm의를 포함 α 한 PI 및 3.6 μm의 α 2 macroglobulin (α 2 M) 10 배 차이 8. 두 단백질은 PPE에 바인딩을 위해 경쟁합니다. 이러한 두 가지 특성, 농도 및 PPE 친화력은 특별히 α 2 M 8을 경쟁의 존재에 정상 혈청에서 α 한 PI를 측정할 수있는 방법을 개발하기 위해 악용되었습니다. 이 방법은 0.3 % 혈청에서와 같은 작은 50 나노미터 μ 한 PI를 검색할 수 있습니다. 2.5 %의 혈청 희석에서 PPE에 대한 α 2 M의 바인딩은 감지되고,이 희석은 약 900 nm의 α 1 PI 및 90 nm의 α 2 M. 포함되어 있습니다

α 2 M, 전체 입을 타액은 20 배...

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공개 사항

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감사의 글

연구는 해리 윈스턴 학술 진흥 재단에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
Sialogogue, 0.05M 시트르산 에다의 Sugarfree 캔디, 4900 후면 N.20th 거리, 필라델피아, PA 19144 무설탕 레몬 물방울
돼지의 췌장의 엘라스타제, 유형 1 (EC 3.4.21.36) 시그마 - 올드 리치, 세인트 루이스, 미주리 63,103 E1250
Succinyl-L-살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide 시그마 - 올드 리치 S4760
Coomassie 브릴리언트 블루 R-250 시그마 - 올드 리치 B7920
조직 문화 - 대우, 96 잘 microplates Becton 디킨슨, 프랭클린 호수, 뉴저지 07417-1886 35-3072
405 nm의 및 595 nm의 용 필터 Microplate Reader를 MTX 랩 시스템, 8456 Tyco 번지 부이lding D, 비엔나, 버지니아 22182 Dynex P97277

참고문헌

  1. Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
  2. Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
  3. Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
  4. Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
  5. Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
  6. de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
  7. Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
  8. Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
  9. Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
  10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
  11. LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
  12. Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
  13. WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).

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