방법 논문

조사를위한 인적 나팔관 모델

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DOI:

10.3791/4036

⸱

2012년 8월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

이 논문에서

요약

우리에 대해 설명 예 생체내 감염 모델입니다. 모든 장기 조직 모델은 조사를 설립 C. trachomatis 유도 병리학.

초록

클라미디아의 trachomatis와 성기 요로 감염증 (C. trachomatis의) 전세계적으로 여성에서 가장 빈번한 전송 성적으로 질병입니다. 병원균의 비효율적인 통관이나 지속성은 상부 성기 요로의 감염을 오름차순과 감염된 조직의 1,2에 만성 염증성 손상을하기로되어 발생할 수 있습니다. 결과적으로 골반 염증성 질환 (PID), 투발의 폐색 및 불임 등의 심각한 임상 sequelae는 3,4가 발생할 수 있습니다.

C.있는 연구의 대부분은 trachomatis는 상피 세포 라인 (예 : C 형 간염-2 세포 HELA-229)이나 생쥐에서 실시되었습니다. 그러나 셀 - 문화 기반 모델과 마찬가지로, 그들은 둘 다 기본 조직의 생리 기능이나 C의 pathophysiology을 반영하지 않습니다 생체내 5 trachomatis 성기 요로 감염증. 또한 한계는 사실에 의해 주어집니다 그 중앙 시그널링 폭포 (예 : IFN-γ mediat세포내 chlamydial 성장을 제어하는 에드 JAK / STAT 신호 경로)는 근본적으로 생쥐와 인간 6,7 사이에 다릅니다. 우리와 다른 그러므로 C. 간의 직접적인 상호 작용을 조사하기 위해 전체 장기 난관 모델을 확립 trachomatis와 인간 난관 세포의 전직 생체내 8,9.

이를 위해 자궁 적출술을받은 여성에서 인간의 나팔관은 C.으로 수집 감염되었다 24 H 포스트 감염 이내 trachomatis serovar 디 표본 어디 클라미디아의 trachomatis을 감지 스캔 전자 현미경 (SEM) 및 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용하면 상피 손상뿐만 아니라 중재 분석 C. 난관 조직의 trachomatis에 포함 형성.

프로토콜

1. 클라미디아의 trachomatis Serovar D 증권의 작성

  1. 네 ML C.으로 HELA-229 세포를 포함하는 지류 175cm 2 세포 배양 플라스크를 감염 버퍼를 SPG의 trachomatis의 디.
  2. 끊임없이 진동하는 동안 37 ° C에서 한 시간 만이라도 품어.
  3. 10% FCS와 240 μl Cycloheximide있는 20 ML DMEM을 추가합니다.
  4. 37시 48 H 위해 humidified 인큐베이터에서 부화 ° C에서 5 % CO 2.
  5. C를 분리하고 파괴하는 5 ML 멸균 유리 구슬, 강한 쉐이크를 추가하십시오 HELA-229 세포를 숨겨주 trachomatis.
  6. 표면에 뜨는를 수집하고 멸균 유리 구슬의 또 다른 5 ML을 추가합니다.
  7. 1 분 용 록 세 번 모두 HELA-229 세포를 파괴하고 릴리스 C.하기 trachomatis.
  8. 5 천 rpmi에서 분 및 4 ° C 원심 분리기 세포 파편을 제거합니다.
  9. 8-10 175cm 2 세포 배양의 감염 뜨는을 모으이 합류 G를 flasksHELA 229 세포와 rown.
  10. 37 1 시간 4 ML SPG 버퍼와 이전의 감염에서 4 ML에 뜨는 ° 지속적인 진동과 C로 모든 휴대용 술병을 품어.
  11. 한 시간 10% FCS 37 ° C에서 5 % CO 2에서 48 H 보육 다음에 230 μl cycloheximide와 15 ML DMEM을 추가한 후.
  12. 5 ML 멸균 유리 구슬을 추가 분리하는 악수와 C를 파괴 HELA-229 세포를 숨겨주 trachomatis.
  13. 표면에 뜨는를 수집하고 멸균 유리 구슬의 또 다른 5 ML을 추가합니다.
  14. 1 분 용 록 세 번 모두 HELA-229 세포를 파괴하고 릴리스 C.하기 trachomatis.
  15. 4에 1000 rpmi에서 5 분 원심 ° C에서 세포 파편을 제거합니다.
  16. 표면에 뜨는를 수집합니다.
  17. 11,000 rpmi로 99 분, 50 ML 팔콘 튜브, 원심 분리기에 뜨는 40 ML을 채웁니다.
  18. 원심 분리 후 뜨는를 버리고 한 ML이 버퍼를 SPG와 함께 펠릿 씻는다.
  19. 를 Homogenize펠렛 -70에서 1, 5 ML Eppendorf 튜브, 저장 ° C에서 사용까지 1 ML의 SPG 및 나누어지는 20 μl 인치 준비된 재고 생물 학적 활동이 설립 HELA-229 세포 감염 모델에서 확인되었다.

2. 인간 나팔관의 준비

  1. 즉시 RPMI는 준비까지 4 항생제없이 ° C를 5퍼센트 FCS를 포함한에서 수술 후 자궁 적출술을받은 여성 스토어 인간 난관 튜브 (HFT). 프로토콜은 Lübeck의 대학 (09-153)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. (53까지 나이 34) 연구에 포함된 여성은 이전에 C의 아무 기록도 없었 trachomatis 감염. 나팔관의 조직은 제왕 섹션 동안이나 luteal 단계에서 증상 자궁​​ fibroids로 인해 hysterectomies 동안 산모의 요청에 peripartum 살균에서 수집된되었다. 모든 HFT는 C.에 대한 부정적인 테스트를했다 PCR에 의한 trachomatis.
  2. 과 RPMI가 포함된 배양 접시에있는 HFT 해부항생제없이 5퍼센트 FCS. 전체 처리하는 동안 조직은 건조 방지를 위해 미디어에 빠져들되어야한다.
  3. 차단하고 수술하는 동안 파괴 결합 조직과 조직을 버리고.
  4. 절개 후 작은 메스로 조심스럽게 HFT를 엽니다.
  5. 자세한 내용은 실험 X 0.5 cm 최대 1cm X 1cm까지 0.5 cm의 크기로 조직의 조각을 준비합니다.
  6. 감염 저장소 HFT 검체의 경우 1 ML RPMI 항생제없이 5% FCS를 포함하는. HFT의 표본은 C의 5.5x10 5 IFU (포함 성형 세대)에 감염되었다 trachomatis.
  7. 37 년 HFT 검체를 품어 ° C, 5 % CO 2와 21% O이뿐만 아니라 37에 ° C, 5 % CO 2와 2퍼센트 24 H에 대한 O 2.
  8. 배양 시간은 4시 최소한 사흘 동안 Monti의 정착액의 표본과 점포를 수집 후 SEM / TEM 준비까지 ° C에서.에게

3. TEM에 대한 HFT 표본의 작성

  1. 용TEM은 Monti의 정착액에서 시료를 제거하고 4 X 5mm 조각 ~ 2 X 2mm를 잘라. 나머지 조직은 SEM을 위해 사용될 수 있습니다.
  2. 한 H에 대한 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35와 조각을 씻으십시오.
  3. 1퍼센트 (W / V) 아쿠아 dest 안에 오스뮴의 tetroxide에서 품어. 하룻밤.
  4. 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35에서 6x5 분 세척하여 과잉 오스뮴의 tetroxide를 제거합니다.
  5. 물에 에탄올의 증가 농도 (V / V) (2 H 30 %, 2 시인데 40 %, 2 시인데 50 %, 2 H 60 %, 박 이상 70 %,이 80 %에 잠복기로 물을 제거 H 1, H 90 %, 1 H 95 %, 1 H 100 %.
  6. 프로필렌 옥사이드 2 X 15 분 동안 에탄올을 씻어하고 이후에 50 % 혼합 (V / V) 프로필렌의 신선한 araldite (모든 구성 요소 포함)을 전송하여 하룻밤 사이에 알을 품다.
  7. 최소 1 H 위해 신선한 araldite (모든 구성 요소를 포함)에게 전송합니다.
  8. 평면 퍼가기 금형으로 전송하고 araldite로 기입하십시오.
  9. 위해 araldite 강화하자60 ° C에서 최소 48 H
  10. 임베디드 시료의 트리밍 후 유리 knifes이나 조직을 다이아몬드 나이프를 사용 ultramicrotome에 세미 얇은 섹션 (700 nm의)를 잘라서 리처드슨의 얼룩에 얼룩.
  11. 다이아몬드 나이프와 구리 그리드 (예 : 150 평방 메쉬)로 전송을 사용하여 극도로 얇은 부분 (약 70 nm의)를 잘라.
  12. 아쿠아 dest 안에 0.5 % (W / V) uranyl 아세트산과 울트라 얇은 부분을 청바지. 3퍼센트 (W / V) 아쿠아 dest 안에 리드 구연산으로 따라갔다. 자동 섹션 제조인 인치 또는 섹션은 격자에게 아쿠아 dest 안에 uranyl 아세트산의 포화 centrifuged 용액에 15 분 출발하여 수동으로 물들일 수있다. 아쿠아 dest 안에 0.3 %의 리드 구연산 (W / V)로 따라갔다.

4. SEM에 대한 HFT 시편의 준비

  1. SEM은 상피는 1.5 X 1cm의 코르크 시트에 위쪽으로 향하게과 Monti의 정착액, 동양에서 시료를 제거하고 곤충 바늘을 사용하여 위치를 고정 때문이다.
  2. 적당한 금속 바구니에 코르크에 표본을 전송하고나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35에서 30 분 동안 씻는다.
  3. 아세톤 / 물 혼합의 증가 농도 (V / V) 6 H 30 %, 6 H로 40 %, 8 H 60 %, 박 이상 70 %, 2 시인데 80 %, 90 %에 표본을 잠복기에 의해 수분을 제거 밤이여 2 시인데 및 100 % (표본 계속 빠져들 유지하기가 매우주의).
  4. 임계점 건조 (온도 40 ° C, 압력 80 바)에 의해 신선한 100 % 아세톤과 건조 표본으로 전송합니다.
  5. 전도성 탄소 시멘트를 사용하여 전도성 탄소 탭을 갖춘 SEM 검체 마운트에서 위쪽으로 향하게 상피와 바늘, 코르크 및 접착제 검체를 제거합니다. 마운트 및 전도성 탄소 탭 사이의 전도성을 향상시키기 위해 액체 전도성 실버를 사용합니다.
  6. 이 coater의 스퍼터 사용하여 시편의 전도성 백금, 금 또는 팔라듐 코팅을 준비합니다.

5. 리처드슨의 얼룩과 준결승 얇은 섹션의 염색법

  1. 슬라이드에서 준 얇은 부분이 건조 해.
  2. 1-2 분 동안 60 ° C에서 솔루션을 더럽히는 것으로 섹션을 청바지.
  3. 아쿠아 dest 안에 씻는다.
  4. 드라이 섹션과 coverslip.

6. 대표 결과

인간 난관 감염 모델 내에서 우리는 비 감염된 컨트롤 (그림 1)과 C. 사이의 상피 형태의 차이를 시각화 할 수 있었다 trachomatis - normoxic 조건 하에서 감염된 튜브 (그림 2). 특색 형태학의 차이가 아닌 감염된 컨트롤에 검색되지 않을 수 난관 상피 세포의 병원체 유발 붓기와 용해를 암시. 세미 얇은 섹션과 전송 전자 현미경을 사용하여 우리는 세포내 C를 증명할 수 있었다 인간 난관 조직을 감염 전 생체내의 trachomatis에 포함 형성 (그림 3, 5)하지만 이외 감염된 컨트롤 (그림 4). 산소 집중으로여성의 성기 요로에 tions 우리도 hypoxic 조건 하에서 우리의 모델을 조사 염증성 과정에서 생리적 조건 11, 그리고 더욱 감소 하에서 이미 낮습니다. 예선 결과는 모델 산소 농도를 변화 아래 chlamydial 성장과 자손을 분석하는 데 유용 나타냅니다. 클라미디아 유도된 내피 세포의 손상은 감염 전에 나팔관 (그림 6)의 경솔한 준비 및 처리를 통해 매개되는 유물로부터 분리되어야한다.

figure-protocol-1
그림 1. 컨트롤 매체에서 하루 인큐베이션 (녹색 화살표가 속눈썹이있는 세포, 파란색 화살표가 아닌 속눈썹이있는 세포를 보여주 표시) 이후에 비 감염된 인간 난관의 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝.

figure-protocol-2
그림 2. 스캐닝 전자 마이크로 인간의 난관 하루 게시물 감염 (흰색 화살표 마르크 파열 포함)를 감염 전직 생체내 C. trachomatis의 사본 (SEM).

figure-protocol-3
그림 3. 세미 얇은 섹션 C. 가진 인간 난관의 감염 이후에 전형적인 세포내 흠도 (흰색 화살표) 1D 표시 trachomatis의 전직의 생체내.

figure-protocol-4
그림 4. 제어 매체에서 하루 배양 후 비 감염된 인간 나팔관의 전송 전자 현미경 (TEM).

figure-protocol-5
전직 생체내 C의 그림 5. 전송 전자 현미경 (TEM) trachomatis는 인간의 난관 하루 게시물 감염 (흰색 화살표가 chlamydial 흠도을 표시)을 감염.

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그림 6. 표본의 경솔한 준비 및 처리 (흰색 화살표 표시가 상피 조직을 destructed)를 통해 손상된 난관의 상피의 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝.

토론

감염된 조직에 병원체 유도된 피해의 시각화는 힘든와 생쥐의 실험 절차에 종종 제한됩니다. 우리는 C를 분석하기 위해 인간의 나팔관에서 전직 생체내 감염 모델을 확립 상단 여성 성기 요로의 trachomatis 감염. 이 방법의 사용으로, 우리는 C를 시각화 할 수 있었다 trachomatis - 언젠가 포스트 감염 내에서 인간 난관의 상피에 손상을 유도. 세포 붓기와 용해가 C로 관찰되었다 전형적인 형태학의 변경 사항이있었습니다 trachomatis - 감염된 나팔관 아니지만 비 감염된 컨트롤 인치 TEM 분석은 chlamydiae가 다시 차별 초등학교 신체뿐만 아니라 지속성을 나타낼 수도 확대 그물 모양 단체와 작은 흠도로 큰 흠도을 보여주는 감염된 조직 내에 일반 세포 개발 사이클을 구현하는 것으로 나타났다. 그러나 혼자 형태학의 그림 repl 구별하는 데 충분하지 않습니다감소 신진 대사를 특징으로하고있다 icating과 지속적인 감염은 antimicrobials 10 저항을 증가했다.

감염된 나팔관에서 상피의 파괴는 C의 파괴에 어느 때문입니다 trachomatis - 세포 성장주기 및 전염성 초등 기관의 릴리스 또는 프로 염증성 크린 시토킨 8 릴리스의 완료 이후에 감염된 상피 세포. 병원체 유발 조직 손상와 C에 대한 호스트 유도된 면역 반응 trachomatis는 내피 세포 기능, fibroblast 리모델링 및 생체내 8,11의 마지막 튜발 불임의 손실로 이어지는 주요 요인 있어야합니다.

이 모델의 주요 한계 중 하나는 초기 C.에 보조 효과 분석을 hampers 염증 세포의 부재이다 난관의 상피의 trachomatis 감염. 그러나 모델은 AP이다서로 다른 환경 조건 (예 : 산소 함량) 및 급성 C.의 초기 호스트 면역 반응을 조사 propriate trachomatis 감염 8,9. 앞으로의 계획은 C.에 대한 antimicrobials의 테스트 모델을 확립하는 것입니다 모든 인간의 나팔관과 2 광자 레이저 스캐닝 현미경에 의해 민족인 상피에서 관찰 다른 발달 단계의 대사 상태를 특성화하는 trachomatis.

공개 사항

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감사의 글

이 작품은 "인터페이스에 염증"우수 DFG-클러스터 (RA-하면, RA-D)에 의해 지원되었다. 우리는 크리스틴 Wischnat의 우수한 기술 지원을위한 감사를드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-8​​02
FCS PAA A15-101
Cycloheximide 시그마 - 올드 리치
버퍼 SPG 여러 아래의 제조법을 참조하십시오
Monti의 정착액 여러 아래의 제조법을 참조하십시오
나트륨 cacodylate 버퍼 여러 아래의 제조법을 참조하십시오
Richardson의 얼룩 여러 아래의 제조법을 참조하십시오

조리법 :

1. 버퍼 SPG

  1. 75g의 자당을 추가합니다.
  2. 2.47 g 나트륨 인산을 추가합니다.
  3. 0.36 g monosodium 인산을 추가합니다.
  4. 0.72 g glutamic 산을 추가합니다.
  5. 아쿠아 이명 령과 1리터로 채웁니다.
  6. 7.3로 산도를 조정합니다.

2. 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35.

  1. 42.80 g dimethylarsenic 산 나트륨 소금을 추가합니다.
  2. 68.46 g의 자당을 추가합니다.
  3. 아쿠아 이명 령과 1리터로 채웁니다. 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼를 얻으려고 말야.
  4. 아쿠아 이명 령과 함께 묽은 용액을 사용하기 전에. 농도를 원하는과 7.35 필요한 경우에 산도를 조절합니다.

3. Monti의 정착액

  1. 156 ML 0.12 M 나트륨 cacodylate 버퍼를 추가합니다. 3.2 아쿠아 dest 안에 25 ML 25% glutardialdehyde를 추가합니다.
  2. 19 ML 추가아쿠아 dest 안에 10 % paraformaldehyde.
  3. 아쿠아 이명 령에서 3 ML 3% CaCl 2를 추가합니다.
  4. 7.35로 산도를 조절하고 아쿠아 이명 령으로 채운다. 312 ML 최후의 해결책합니다.

4. 리처드슨의 얼룩

  1. 아쿠아 dest 안에 1% 수성 붕사 솔루션과 1% AZUR II의 1 % 메틸렌 블루의 동등한 부분을 섞는다.

참고문헌

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