의 단백질 단지의 식별 대장균 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Summary

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를 설명 대장균도 셀 당 낮은 사본 번호부터 근처의 동질성에 안정적인 멀티 단백질 복합체를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수있는.

Abstract

대부분의 세포 프로세스 macromolecular 어셈블리, 단백질 - 단백질 상호 작용의 체계적인 식별 (PPI)와 단지는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공하고 생물 시스템 ^{1, 2의} 이해를 향상시킬 수 있습니다 다중 단백질의 subunit 구성의 식별에 의해 중재되기 때문입니다. 물리적 상호 작용 대량 분석법 (APMS)와 함께 chromosomally 태그 단백질의 친 화성 정화에 따라 거의 생리적 조건 하에서 내생 단백질 단지의 높은 신뢰 vialarge 규모의 절연 및 특성에 매핑 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 효모, 파리, 웜, 포유류의 세포 및 박테리아 ^1-6 등의 evolutionarily 다양한 생물에 적용되었습니다. 특히, 우리는 GE를 사용하여 양식 그람 음성 대장균에서 선호도 - 정화 기본 단백질 단지의 카르복시 - 터미널 순차적 펩타이드 선호도 (SPA) 듀얼 태그 시스템을 생성 한기본 생물학, prokaryotes ^{1, 2, 7} 보존 프로세스의 게놈 전체의 조사에 적합 아르 netically - 다루기 쉬운 호스트 실험실 변종. 우리 SPA 태그 시스템은 효모 ^{8, 9} 원래 개발 된 직렬 선호도 정화 방법 유사하며, calmodulin 바인딩 구체적인 담배 에칭 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소의 절단 사이트에서 다음 펩타이드 (CBP) 및 사본 3 부를 구성되어 있습니다 연관성 농축의 연속 2 발을 허용 플래그 에피토프 (3 배 플래그)의. 카세트 증폭 후, SPA-태그와 선택 마커를 인코딩 순서 특정 선형 PCR 제품은 통합되어 transiently 고효율 heterologous 박테리오파지 람다 재결합 시스템 ^(10)을 표현하도록 유도하는 DY330 배경으로 카르복시 - 터미널 fusions와 같은 프레임으로 표현. calmodulin 및 안티 플래그 연관성 구슬을 사용하여 후속 듀얼 단계 정화는 높은 선택을 가능하게대규모 문화도 낮은 풍부한 단백질 단지의 효율적인 복구. 직렬 질량 분석법 그 다음 높은 감도 (낮은 nanogram 검출 한계)를 안정적으로 공동 정화 단백질을 식별하는 데 사용됩니다.

여기, 우리는 우리가 일반적으로 체계적인 단백질 태그, 정화 및 대량 E.에서 수용성 단백질 단지의 분석법 기반의 분석을 위해 사용하는 자세한 단계별 절차를 설명 까지 확장 될 가능성이 recombineering 의무가있는 특정 기회 병원균 등 다른 세균 종에 맞게 할 수 있습니다 대장균. 그 결과 물리적 상호 작용은 종종 재미있는 예상치 못한 구성 요소와 소설 기계론의 링크를 제안 연결을 공개 할 수 있습니다. 이러한 유전자 (유전자 유전자) 상호 작용과 예측은 이중에서 다중 단백질 단지의 글로벌 분자 조직의 해설을 촉진 할 수 게놈 - 컨텍스트 (GC)와 같은 다른 분자 협회 데이터와 PPI 데이터의 통합ological 경로. E.에 대해 생성 된 네트워크 대장균은 기능 주석이 현재 부족하는 다른 미생물의 orthologous 유전자 제품의 기능 구조에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. E.의 유전자 별 SPA 태그 추가 구축 대장균 DY330 변형

1. 플라스미드 pJL148은 SPA-태그 DNA 시퀀스와 kanamycin 항생제 저항 아이콘 카세트 (관 ^R)를 포함한는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 ^7의 템플릿으로 사용됩니다. 27 BP (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') 태그 특정 앞으로 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈 즉시 상류에 위치한 45 NT 유전자 특정 앞으로 프라이머, 그리고 45 NT 유전자 특정 역방향 프라이머, 즉시 위치 94 : 27 BP (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT의 -3 ') 태그 특정 역 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈의 하류는 다음과 PCR 사이클 조건을 사용하여 pJL148에서 SPA-태그와 칸 ^{R 카세트를} 증폭하는 데 사용됩니다 5 분에 대한 ° C, 1 분, 68 1 분, 55 ° C ° 10 분에 68 ° C에 이어 2 분 10 초에 C에 대해 94 ° C의 30주기. 이 증폭 시퀀스는 서비스를 제공ectopically 소개 λ - 레드 상동 재조합 기계를위한 S 기판 (아래).
2. PCR 제....

Results

내인성 수준에서 발현되는 태그가 지정된 미끼 단백질이 로그 상 배양에서 친화성 정제되면 샘플을 은 염색 겔에서 실행하여 분리된 안정된 복합체의 개별 폴리펩티드 성분을 시각화했습니다. 또한 친화성 정제 단백질 샘플의 두 번째 부분에 젤 프리 탠덤 질량 분석법(LCMS)을 적용하여 해당 폴리펩티드 염기서열을 식별했습니다. 이 APMS 절차의 효과는 E. coli에서 친화성 정제된 RNA 중합효소(RNAP) 및 SufBCD 철-황(Fe-S) 단백질 복합체의 구성 요소에 대한 대표적인 SDS-PAGE 분석을 통해 확인할 수 있습니다(그림 1C 및 D). SPA 태그가 지정된 RNAP^{σ 70}(RpoD)과 기능을 알 수 없는 단백질인 YacL은 모두 α(RpoA), β(RpoB) 및 β'(RpoC) 소단위와 같은 핵심 RNAP 효소 및 RNAP 재활용 인자(HepA)와 특이적으로 공동 정제되었습니다. 태그가 지정된 RpoD와 달리 YacL은 필수 전사 종결/.......

Discussion

여기에 설명 된 SPA 기반 APMS 방식의 핵심 부분은 태그가함으로써 정상적인 유전자 조절을 보장하는 것은 유지 (예. 기본 미끼업자의 앞 표현 수준이 어리둥절하지 않습니다, 보존) 및 안정적-관련 기본입니다, 자연 염색체 컨텍스트 내에서 수행되는 것입니다 단백질 단지는 거의 내생 수준에서 회수하고 있습니다. 오페론 극성 문제도 선택 마커의 외측 중심의 발기인을 포함하여 피할 수 있습니다. 이 SPA 태그 추가 방법은 subunits는 세균 세포 당 몇 분자으로 표현 된 경우에도 막 관련 어셈블리를 포함한 근처의 동질성에 대한 낮은 풍부한 단지,​​의 구성 요소를 정화 할 수있을만큼 효과적입니다. 전반적으로,이 프로토콜은 E.에 태그 가용성 단백질의 대형 세트를 정화에 쉽게 스케일 업 할 수 있습니다 대장균이나 원칙적으로 recombineering를 통해 태그이 가능하는 다른 박테리아 종, 또는 사람이 소유하고 자연스럽게 높은 transformaAcinetobacter, 타겟 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. 항생제
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
효모 추출물	Bioshop	#YEX 555
글리세롤	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3. 박테리아 균주 및 플라스미드
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR 및 전기영동 시약
Taq DNA 중합효소	발효#	EP0281
10 X PCR 완충액	발효	# EP0281
10 mM dNTP	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
로딩 염료	NEB	#B7021S
에티듐 브로마이드	Bioshop	# ETB444
10X TBE 버퍼	Thermo Scientific	# 28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
붕산	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
5입니다. 플라스미드 분리 및 클린업 키트
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
6. PCR 및 변환 장비
thermal cycler	BioRad	iCycler,
아가로스 젤, 전기영동,	BioRad
Electroporator,	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 ° C 수조 쉐이커		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 원심분리기	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 ° C 셰이커	뉴브런즈윅 사이언티픽, 미국
32 ° C 대형 셰이커	뉴 브런 즈윅 사이언티픽, 미국
32 ° C 플레이트 인큐베이터	Fisher Scientific
7. 전기영동 및 웨스턴 블로팅
아크릴아미드 단량체, N,N'-메틸렌비스-아크릴아미드	Bio-Rad	#161-0125
과황산암모늄	Bioshop	# AMP001
n-부탄올	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 여과지	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
니트로셀룰로오스 멤브레인	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 항체	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained 단백질 분자량 표준	Bio-Rad	#161-0363
화학발광 시약	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
프로테아제 억제제	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9. 친화성 정제 시약 및 장비
0.8 x 4 cm Bio-Rad 폴리프로필렌 컬럼	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
10. 은 염색 시약
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
나트륨-티오설페이트	Sigma	#S-7143
질산은	Fischer Scientific	#S181-100
포름알데히드	Bioshop	#FOR201
탄산	나트륨바이오샵	#SOC512
11. 단백질 식별용 시약 및 장비
Trypsin Gold, 질량 분석 등급	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
아세토니트릴	시그마	#A998-4
포믹 산성	시그마	#F0507
HPLC 등급 물	시그마	#95304
요오드아세트아미드	시그마	#16125
밀리포어 집팁	밀리포어	# ZTC18M960
~10cm of 3 μ m Luna-C18 수지	Phenomenex
Proxeon nano HPLC 펌프	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos 질량 분석기		Thermo Fisher Scientific
12. 실험기구
4리터 원뿔형 플라스크	VWR	#89000-372
50ml 폴리프로필렌 팔콘 튜브	모든 공급업체
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	모든 공급업체
250ml 원추형 플레이크	VWR	#29140-045
15ml 멸균 배양 튜브	Thermo Scientific	#366052
극저온 바이알	VWR	#479-3221-80
° C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
스피드 진공 시스템	Thermo Scientific
버퍼 및 솔루션 1. 1리터 훌륭한 국물(TB) 미디어 11g Bio-Tryptone 22g 효모 추출물 2% 글리세롤 50ml 칼륨 염 스톡 해결책 < / p > 2. 칼륨 염 원료 용액 < / p> 1.5 M K 2 < / sub > HPO 4< / sub> 0.35 M KH 2< / sub>PO4 3. 초음파 처리 완충액 < / p > 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA < > 10 % 글리세롤 < > 사용하기 전에 프로테아제 억제제 (PI)와 0.1-0.5 mM TCEP를 첨가하십시오 < / p > 4. AFC 버퍼 < / p > 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) < / > 150 mM NaCl < > 0.1 % 세제 < > 사용하기 전에 PI 및 0.1-0.5 mM TCEP를 추가하십시오 < / p > 5. TEV 절단 완충액 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 세제 사용하기 전에 PI와 0.1-0.5 mM TCEP를 추가하십시오 6. 칼모듈린 결합 완충액 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% 세제 사용하기 전에 PI와 0.1-0.5 mM TCEP를 첨가하십시오 7. 칼모듈린 세척 버퍼 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. 칼모듈린 용출 완충액 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. 현상액 (1L) 37% 포름알데히드 탄산나트륨 30g 증류수 1000ml 10. 소화 완충액 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. 습윤 및 평형 용액 < / p > 0.1 % 포름산 중 70 % 아세토 니트릴 (ACN) < / p > 12. 세척 용액 < / p > 100 % H2< / sub>O 0.1 % 포름산< / p>