나중에 인큐베이션 단계 (햄버거와 해밀턴 무대 (HH) 22 세 이상)에서 닭 배아에 유전자 전달의 방법을 설명합니다. 이 방법은 단점을 극복 비켜에서 electroporation은 나이 닭 배아에 적용하여 유전자 기능과 기존의 개발 단계에서의 규제를 공부하는 유용한 기술입니다.
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이 논문에서
요약
초록
닭 배아가 배아 발달 동안 유전자 기능과 규제를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 비켜 electroporation에는 강력한 오버 특급 외인성 유전자에 대한 방법이나 닭 배아 1 생체내의 내생 유전자를 다운 조절입니다. 이러한 유전자 plasmids 인코딩 유전자 2-4, 작은 간섭 RNA (siRNA) plasmids 5, 작은 합성 RNA oligos 6 및 morpholino 안티 센스 oligonucleotides 7 등 다양한 건축물에 쉽게 electroporation에 의해 닭 배아로 transfected 수 있습니다. 그러나 비켜 electroporation에의 응용은 초기 배양 단계 (단계 HH20 미만 - 함부르크와 해밀턴에 따라)에 배아로 제한됩니다 8, 나중 단계에서 배아에서의 응용을위한 몇 가지 단점은 (무대 HH22보다 오래된 없습니다 - 약 3.5 개발 일). 예를 들어, 나중 단계에 vitelline 막이 우스입니다조 막에 붙어 있으며 껍질에 창을 열지 앨리 배아의 죽음에 그 결과 혈관의 파열을 초래, 이전 배아는 그것이 배아를 액세스하고 조작하기가 어렵습니다 vitelline 및 allantoic 혈관에 의해 적용되며, 이전 배아 움직이지 셸의 상대적으로 작은 창을 통해 방향을 제어하기 어려운 강력하고 있습니다.
이 프로토콜에서는 늦은 단계 (단계 HH22보다 오래된)에서 닭 배아에 유전자 전달을위한 전직 비켜 electroporation 방법을 보여줍니다. 전 비켜 electroporation의 경우 배아가 페트리 접시 9 배양해하고 vitelline 및 allantoic 혈관이 널리 퍼져있다. 이러한 조건에서 기존의 닭 배아 쉽게 액세스하고 조작합니다. 따라서이 방법은 기존의 닭 배아에 적용 비켜 electroporation에의 단점을 극복. 이 방법을 사용 plasmids 쉽게 여러 부분으로 transfected 수오래된 닭 배아 10-12니다.
프로토콜
1. 예 비켜 문화
- 신선한 수정된 달걀이 부화 60 %의 습도와 37.5에서 강제 통풍 인큐베이터 (BSS160, Ehret, 독일) ° C에서 그들의 긴 측면에 놓여있다. 이상 1 주일 동안 12 ° C에서 저장된 계란을 사용하지 않아야합니다.
- 2.5 일 (무대 HH17에 대한)에 대한 인큐베이션 후, 계란을 제거하고 해독을위한 방향을 나타내는 연필로 상단에 라벨을 달고.
- 크래킹하기 전에 깨끗한 대형 배양 접시 (; Greiner 생물 하나 게엠베하, 독일 145mm의 직경)로 약 20 ML 멸균 증류수를 부어.
- 대형 배양 접시에, 또 다른 작은 멸균 페트리 접시를 (Greiner 바이오 - 하나 게엠베하 94mm의 직경) 놓습니다.
- 날카로운 금속 모서리에 대한 바닥에 알을 약쟁이, 조심스럽게 달걀을 열고 작은 배양 접시에 각 계란의 전체 내용을 전송합니다.
- 뚜껑과 함께 큰 페트리 접시를 커버하여 다른 인큐베이터 (바인더 게엠베하, Tuttlinge, 독일)에 넣어추가로 문화의 37.5에서 ° C에서 약 60 %의 습도. 일 원하는 번호 부화 후 배아가 electroporation을 위해 사용될 수 있습니다.
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토론
이 프로토콜은 전 비켜 electroporation에 의해 기존의 닭 배아 (예 : E6의 광학 tectum로)로 유전자 전달을위한 가이드를 제공합니다. 이 방법은 기존의 닭 배아에 electroporation의 사용을 확장하고 쉽게 나중 단계에서 생체내의 유전자 기능을 연구를 위해 많은 실험실에 적용할 수 있습니다. E4에서 최소한 E7에 태아도 성공적으로이 방법에 의해 electroporated 수 있으며 electroporated 배아는 E15 11까지 생존이 될 수 있습니다. 뇌 이외에도이 방법은 또한 닭 사지 시스템을 11로 유전자 전달에 사용될 수 있습니다.
특별한주의는 전 비켜 electroporation에 의해 지불되어야합니다. 작은 배양 접시가 E2.5 주위에서 연주 균열 살균 계란 있어야;. 예를 들어, 전직 비켜 문화 배아 높은 생존을 얻기 위해 사용되는.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 독일 학술 진흥 재단 (; LU1455/1-1 DFG)에서 교부금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Electroporator | Nepa 진, 일본 | CUY21 - 편집 | |
| 전극 | Nepa 진, 일본 | CUY661-3X7 | |
| 계란 인큐베이터 | Ehret, 독일 | BSS160 | |
| 배아 인큐베이터 | 바인더 게엠베하, 독일 | ||
| 형광 현미경 | Keyence, 독일 게엠베하 | BZ-8000 | |
| 페트리 접시 | Greiner 바이오 하나 게엠베하, 독일 | ||
| Microelectrode의 풀러 | 세계 정밀 계측기, 독일 | PUL-100 |
참고문헌
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C.
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