O의 정의 농도와 대기를 생성하는 지속적인 흐름 hypoxia 챔버를 사용하는 방법을 본 논문 세부 정보 2 생물 학적 반응을 이해하는 O를 감소하는 방법 2. 이 시스템은 설정 및 유지 관리가 쉬우며, O 다양한 맞게 충분히 유연 2 농도 및 모델 시스템
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이 논문에서
요약
초록
모든 metazoans 하나 알려진 예외 1, 생존하기 위해 산소가 필수적입니다. 감소 O 2 용성 (hypoxia)는 질병, 일반 개발 또는 환경 조건 2-5의 변화 상태 동안에 발생할 수 있습니다. hypoxia에 대한 응답에 관여하는 세포 신호 전달 경로를 이해하는 것은 뇌졸중의 암으로, 다양한 인간 pathologies에 대한 치료 전략에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 목표는 유전자 의무 모델 생물의 제어 hypoxic 노출과 관련된 기술적인 문제에 의해 최소한 부분적으로 장애가되었습니다.
선충류의 Caenorhabditis elegans를 이상적으로 그것이 문화에 쉽게이며, 유전자 조작으로, hypoxic 응답의 연구를위한 모델 생물로 적합합니다. 또한, 그것은 C. 이후 혼란함을 주죠 효과없이 특정 hypoxic O 2 농도에 대한 세포 반응을 연구하는 것이 가능 elegans는 O 2 (을 얻을및 확산 다른 건가)는 등의 촉진 호흡기 시스템 6으로 반대했습니다. hypoxia에 대한 응답에 참여하는 것으로 알려진 요인은 C로 보존된다 elegans. hypoxia에 대한 실제 응답을 사용할 수 있습니다 O 2의 특정 농도에 따라 달라집니다. C로 elegans은 hypoxia를 운영하는 노출 hif-1에 의해 주로 매개 transcriptional 응답을 elicits, 고도로 보존되어 hypoxia-inducible의 전사 인자 6-9. C #. elegans의 배아는 O 2 7,10 5,000-20,000 PPM에서 생존하기 위해 hif-1이 필요합니다 . Hypoxia는 "정상적인 O 2보다 적은"에 대한 일반적인 용어입니다. Normoxia (일반 O 2) 또한 정의하기 어려울 수 있습니다. 우리는 일반적으로 normoxia 될 수 210,000 PPM O, 2 실내 공기를 고려하십시오. 그러나, 그것은 표시되었습니다 C. elegans은 5~12%에서 O 2 농도 (50,000-120,000 PPM O 2) 11 행동 선호하고 있습니다. 리터에서arvae와 어른, 5,000 PPM O 2 12 년 hypoxia 유발 diapause을 방지하기 위해 hif-1 행위. 그러나 hif-1 O 2의 낮은 농도 (산소 결핍, 운영 정의 <10 PPM O 2) 13 응답으로 역할을하지 않습니다. 산소 결핍, C로 elegans은 모든 미세 띄는 활동이 10을 중단하는 정지 애니메이션의 가역 상태로 들어갑니다. 서로 다른 조건에서 다른 생리적 반응이 발생한다는 사실은 O 2의 hypoxic 농도 이상의 실험적인 통제를 할 수의 중요성을 강조 표시합니다.
여기서는 O 2의 농도로 정의된 신뢰할 수 있고 재현성 hypoxic 조건을 만들어 환경 챔버의 건설 및 구현을위한 방법을 제시한다. 지속적인 흐름 방식은 챔버의 급속한 평균을 보장하고 시스템의 안정성을 증가시킵니다. 또한, 투명성과실을 접근 hypoxia에 노출되는 동물의 직접적인 시각화를 가능하게합니다. 우리는 더 이상 C를 수확의 효과적인 방법을 설명 elegans 샘플 빠르게 hypoxia에 노출된 후, 어느 hypoxia 10,14에서 발생 급속히-반대로 많은 변화를 관찰해야합니다. 이 방법은 쉽게 다른 모델 시스템 및 건가 다양한 포함한 개인 실험실 요구에 대해 수정할 수 있습니다 기본적인 기반을 제공합니다.
프로토콜
1. 환경 챔버 구축
- 프로젝트의 범위에 필요한 챔버의 작은 합리적인 볼륨을 선택합니다. 상공 회의소는 (O 2) 기름이 스며들지 않는 재료를하셔야합니다. Pyrex의 결정화 요리 Anaeropack 상자, 또는 대형 주물 - 아크릴 상자 (Ellard 계장)은 사용하실 수 있습니다. 우리는 9 개의 50mm 접시는 100 X 50 Kimex의 결정화 접시에 들어갈 수있는 것으로 나타났습니다. 유리 접시는 Pyrex의 결정화 요리 뚜껑으로 사용할 수 있습니다.
- 선택한 챔버에 구멍을 드릴과 호스 미늘 피팅 (콜 Parmer)에 Luer 플라스틱 남성과 잘 맞습니다. 피팅은 파이프 피팅이나 에폭시로 확보할 수 있습니다. 가스 챔버로의 흐름과 아웃 할 수 있도록 컨테이너의 반대쪽에 유사한 피팅을 설치합니다. 가능하면 난류 혼합을 향상시킬 구멍을 상쇄.
- O이 공동을위한 표준을 인증하고 정의한 O 2 농도 (N 2와 함께 균형)로 압축된 가스 탱크를 구합니다anoxic 조건 ntent이나, 순수 N 2 (<10 PPM O 2). 야근에 산소 레벨을 방해하지 않도록 장기적인 연구를위한 자동 스위치 오버 레귤레이터를 사용합니다.
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토론
이 방법은 실험실에서 유지되는 산소의 정확한 농도가있는 환경을 허용 hypoxic 환경을 구축을위한 전략을 제시합니다. 이러한 챔버 스는 O 2의 구체적인 낮은 농도로 유기체를 노출하고 분자 및 생리 출력을 모니터링하는 간단한 방법을 제공합니다. 설명된 환경 챔버 실험실 대신 상업적으로 구입하여 조립되고 따라서 실험의 필요에 맞게 수정할 수 있습니다.
이 방법 중 하나는 뚜렷한 장점은 지속적인 흐름 디자인입니다. 이것은 일반적으로 외부 O 2 농도가 훨씬 높은 경우 (실내 공기에 210,000 PPM O 2) 실에서 O 2의 낮은 농도를 유지 함께 발생되는 어려움을 없애줍니다. 대안은 hypoxic 환경이 밀폐된 챔버에서 유지되는 중지 흐름 방식입니다. 탐지하기 어려울 수 있습니다 비록 작은 누출, 사전정지 - 흐름 방법을 사용 hypoxic 조건의 유지를 빼낼. 연속 흐름 방식은 지속적으로 압축 .......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 토론 및 원고의 비판적 읽기를 위해 밀러는 실험실의 구성원 감사드립니다. 이 작품은 DLM과 DLM에 건강 상을 R00 AG030550의 국립 연구소로 노화의 기본적인 생물의 우수의 네이선 충격 센터에서 새로운 탐정 수상에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 튜빙 (FEP와 PTFE) | 콜 Parmer Tygon | 요 - 95821-00 (1 / 8 "FEP) 06605-27 (16분의 1 X 1 / 8 "PTFE) 'R-3603 | |
| 압축 피팅 | 시애틀 유체 시스템 | 06363-58 (M. 커플러 16분의 1 ") 06363-62 (F. 커플러 16분의 1 ") 06363-60 (M. 커플러 1 / 8 ") 06363-61 (F. 커플러 1 / 8 ") | |
| 유동관 | 알보그 | PMR3-010073 (3 출력) PMR1-013520 (1 출력) | |
| 질량 유량 제어기 | 시에라 인 스트 루먼트 | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (질량 Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (스마트 Trak 2) | |
| 압축 가스 탱크 | AirGas | 주문 제작 | |
| 호스 미늘 이음쇠에 플라스틱 남성 Luer | 콜 Parmer | 45505-41 (500 시리즈 16분의 1 ") | |
| 아크릴 상자를 던져 | Ellard 계측 | 주문 받아 만든 | |
| 파이프 피팅 (브래스 또는 스테인리스 스틸) | 시애틀 유체 시스템 | B-402-1 (1 / 4 "너트) B-200-3 (1 / 8 "유니온 티) B-400 세트 (1 / 4 "ferrules) B-QM2-B1-200 (QM 바디 QC) B-200-1-2 (팔분의 일 X 1 / 8 "남성 conn) | |
| 다우 코닝 진공 그리스 | 시그마 - 올드 리치 | Z273554 | |
| AnaeroPack 상자 | Misubishi 가스 화학 회사 | R684004 (0.4 리터) R685025 (2.5 리터) R685070 (7.0 리터) | |
| Pyrex 가스 세척 병 | 시그마 - 올드 리치 | CLS31770500C (500 ML) CLS31770250C (250 ML) CLS31770125C (125 ML) | |
| 팔미트산 | 시그마 - 올드 리치 | P0500 | |
| 염소 안티 - 마우스 IgG-양고추냉이 퍼옥시데이즈 | 남부 바이오 어소 시에이츠 | 1032-05 | |
| SuperSignal 웨스트 피코의 Chemiluminsecent 기판 | 피어스 화학 | 34,077 | |
| 100 X 50 유리 결정화 요리 | Kimax 킴블의 | 23,000 |
참고문헌
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....
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