방법 논문

에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기 C. elegans

DOI:

10.3791/4088

⸱

2012년 7월 20일

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Washington, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O의 정의 농도와 대기를 생성하는 지속적인 흐름 hypoxia 챔버를 사용하는 방법을 본 논문 세부 정보 2 생물 학적 반응을 이해하는 O를 감소하는 방법 2. 이 시스템은 설정 및 유지 관리가 쉬우며, O 다양한 맞게 충분히 유연 2 농도 및 모델 시스템

초록

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모든 metazoans 하나 알려진 예외 1, 생존하기 위해 산소가 필수적입니다. 감소 O 2 용성 (hypoxia)는 질병, 일반 개발 또는 환경 조건 2-5의 변화 상태 동안에 발생할 수 있습니다. hypoxia에 대한 응답에 관여하는 세포 신호 전달 경로를 이해하는 것은 뇌졸중의 암으로, 다양한 인간 pathologies에 대한 치료 전략에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 목표는 유전자 의무 모델 생물의 제어 hypoxic 노출과 관련된 기술적인 문제에 의해 최소한 부분적으로 장애가되었습니다.

선충류의 Caenorhabditis elegans를 이상적으로 그것이 문화에 쉽게이며, 유전자 조작으로, hypoxic 응답의 연구를위한 모델 생물로 적합합니다. 또한, 그것은 C. 이후 혼란함을 주죠 효과없이 특정 hypoxic O 2 농도에 대한 세포 반응을 연구하는 것이 가능 elegans는 O 2 (을 얻을및 확산 다른 건가)는 등의 촉진 호흡기 시스템 6으로 반대했습니다. hypoxia에 대한 응답에 참여하는 것으로 알려진 요인은 C로 보존된다 elegans. hypoxia에 대한 실제 응답을 사용할 수 있습니다 O 2의 특정 농도에 따라 달라집니다. C로 elegans은 hypoxia를 운영하는 노출 hif-1에 의해 주로 매개 transcriptional 응답을 elicits, 고도로 보존되어 hypoxia-inducible의 전사 인자 6-9. C #. elegans의 배아는 O 2 7,10 5,000-20,000 PPM에서 생존하기 위해 hif-1이 필요합니다 . Hypoxia는 "정상적인 O 2보다 적은"에 대한 일반적인 용어입니다. Normoxia (일반 O 2) 또한 정의하기 어려울 수 있습니다. 우리는 일반적으로 normoxia 될 수 210,000 PPM O, 2 실내 공기를 고려하십시오. 그러나, 그것은 표시되었습니다 C. elegans은 5~12%에서 O 2 농도 (50,000-120,000 PPM O 2) 11 행동 선호하고 있습니다. 리터에서arvae와 어른, 5,000 PPM O 2 12 년 hypoxia 유발 diapause을 방지하기 위해 hif-1 행위. 그러나 hif-1 O 2의 낮은 농도 (산소 결핍, 운영 정의 <10 PPM O 2) 13 응답으로 역할을하지 않습니다. 산소 결핍, C로 elegans은 모든 미세 띄는 활동이 10을 중단하는 정지 애니메이션의 가역 상태로 들어갑니다. 서로 다른 조건에서 다른 생리적 반응이 발생한다는 사실은 O 2의 hypoxic 농도 이상의 실험적인 통제를 할 수의 중요성을 강조 표시합니다.

여기서는 O 2의 농도로 정의된 신뢰할 수 있고 재현성 hypoxic 조건을 만들어 환경 챔버의 건설 및 구현을위한 방법을 제시한다. 지속적인 흐름 방식은 챔버의 급속한 평균을 보장하고 시스템의 안정성을 증가시킵니다. 또한, 투명성과실을 접근 hypoxia에 노출되는 동물의 직접적인 시각화를 가능하게합니다. 우리는 더 이상 C를 수확의 효과적인 방법을 설명 elegans 샘플 빠르게 hypoxia에 노출된 후, 어느 hypoxia 10,14에서 발생 급속히-반대로 많은 변화를 관찰해야합니다. 이 방법은 쉽게 다른 모델 시스템 및 건가 다양한 포함한 개인 실험실 요구에 대해 수정할 수 있습니다 기본적인 기반을 제공합니다.

프로토콜

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1. 환경 챔버 구축

  1. 프로젝트의 범위에 필요한 챔버의 작은 합리적인 볼륨을 선택합니다. 상공 회의소는 (O 2) 기름이 스며들지 않는 재료를하셔야합니다. Pyrex의 결정화 요리 Anaeropack 상자, 또는 대형 주물 - 아크릴 상자 (Ellard 계장)은 사용하실 수 있습니다. 우리는 9 개의 50mm 접시는 100 X 50 Kimex의 결정화 접시에 들어갈 수있는 것으로 나타났습니다. 유리 접시는 Pyrex의 결정화 요리 뚜껑으로 사용할 수 있습니다.
  2. 선택한 챔버에 구멍을 드릴과 호스 미늘 피팅 (콜 Parmer)에 Luer 플라스틱 남성과 잘 맞습니다. 피팅은 파이프 피팅이나 에폭시로 확보할 수 있습니다. 가스 챔버로의 흐름과 아웃 할 수 있도록 컨테이너의 반대쪽에 유사한 피팅을 설치합니다. 가능하면 난류 혼합을 향상시킬 구멍을 상쇄.
  3. O이 공동을위한 표준을 인증하고 정의한 O 2 농도 (N 2와 함께 균형)로 압축된 가스 탱크를 구합니다anoxic 조건 ntent이나, 순수 N 2 (<10 PPM O 2). 야근에 산소 레벨을 방해하지 않도록 장기적인 연구를위한 자동 스위치 오버 레귤레이터를 사용합니다.
  4. hypoxia에 대한 Organismal 반응은 온도 의존 15로 표시되었습니다. 인큐베이터에 챔버를 배치함으로써 서로 다른 온도 유지하실 수 있습니다. 인큐베이터 내의 온도가 고르지과 같은 수, 비가 계속 챔버 내부 온도를 측정하는 온도 데이터 로거를 이용하기 위해 신중한 것입니다.

2. 환경 상공 회의소에 가스 연결

  1. 모든 연결의 경우 스냅 커넥터 또는 압축 피팅 중으로 연결되어 하나 여덟째 인치 바깥 지​​름 튜브를 사용합니다. 튜빙은 플루오르 에틸렌 프로필렌 등 O 2 (FEP) 또는 나일론 (콜 Parmer)로 스며들지 및 unreactive 있어야합니다. 완성된 설정의 도식 들어, 그림 1을 참조하십시오.
  2. co.kr 사이트를 연결합니다같은 질량 유량 제어기 (시에라 인 스트 루먼트) 또는 rotameter (알보그)와 같은 흐름 제어 장치에 누를 가스 탱크. 탱크의 상류 압력이 유동 장치의 범위와 호스 미늘 피팅 내에 있는지 확인하십시오. 2 단계 규제는 일반적으로 원하는 압력으로 설정 두 번째 단계로, 사용하는 [적절한 유량를 선택 3 번 섹션을 참조]
  3. (그림 1 참조) 가스 배기를위한 두 번째 피팅을 개방하고 나서 환경 챔버에 피팅 중 하나에 나서 직접 fritted 실린더와 가스 세척 병을 사용하여 증류수를 통해 기포에 의한 하이드 레이트 가스,. 단기 과정의 경우 가스 수화는 플레이트 dessication 방지하지만, 습도 모니터링은 장기간 연구해야 할 수도 있습니다.
  4. 다우 코닝 진공 그리스는 챔버를 봉인하는 데 사용할 수 있습니다. 챔버의 뚜껑에있는 장소의 가중치는 완벽한 밀봉을 보장합니다. 단단히 밀봉하고 적절한 흐름을 확인하려면 Y의 손바닥에 물이 작은 수영장을 보유우리가 장갑 낀 챔버에 나가 피팅까지 손, 거품이 있는지 확인합니다.

3. 유속 선택

  1. 혼합 완벽한 가정, 기체 분위기의 90 %의 가스 교환 챔버 볼륨 (Fick의 법칙) 교체 때마다 있습니다. 예를 들어, 100 CC / 분의 유량과 100 CC 챔버에서 챔버에서 원래 집안 공기는 1 분 후에 원하는 가스의 90 %로 대체되고 asymptotically 90% 매 순간으로 완전한 교환을 접근합니다 그 이후.
  2. 높은 유동 속도와 작은 용기가 더 빨리 원하는 산소 농도에 도달합니다. 100 X 50 Kimex 용기 (400 CC), 120 CC / 분의 유량 10 분 (3 교류)의 99.9 % 교환에 도달합니다. 이 유량은 대부분의 산소 조건에 적합합니다. 우리의 지식에 O 2 농도의 변화의 속도는 C에서 반응에 미치는 영향의 체계적인 조사를 한번도 못 봤는데요 elegans.

  1. hypoxic 조건에 노출 웜은 일반적으로 한천 플레이트의 표면을 탈출. 이것을 방지하기 위해 접시 가장자리 주위 팔미트산 (에탄올 10 밀리그램 / ML)의 반지를 넣습니다. 팔미트산은 물리적인 장벽을 형성 에탄올 증발로 용액 중에 올 것이다. 팔미트산 장벽은 달걀 누워 생산력 혹은 C.의 수명의 속도에 영향을 미치지 않습니다 elegans 16,17. 내는가 hypoxic 조건에서 더 자주 발생하지 않으므로 추가적인 예방 조치는 일반적으로 필요하지 않습니다.
    1. unseeded 선충류 성장 매체 (NGM) 접시 18 알칼리 표백 솔루션의 작은 방울로 gravid 성인 표백하여 동기화된 인구를 생성합니다. 표준 대규모 배치 염소산 표백 프로토콜와는 달리, NGM 플레이트의 표면에 표백제 용액 한 방울에 1-100 동물을 선택 후 표백 솔루션 판으로 흡수하도록
    2. 이것은 생존 13 줄일 수 있으므로, hypoxia로 표백된 배아를 노출하지 마십시오. 젊은 배아 (2-4 세포)를 수집하려면 gravid 성인은 hypoxia에 대한 후속 노출에 대해 입을 pipet으로 접시로 옮겨 면도날과 배아와 물을 작은 볼륨으로 썰어 수 있습니다.
  3. 환경 챔버에서 번호판을 밀봉합니다. 컨트롤 동물 취급 웜 같은 온도에서 normoxia (집안 공기)에 보관한다. 집안 공기에 남은 샘플 및 하우스 공기가 그들 위에 흐르는과 동일 챔버 유지 이들 사이 띄는 차이가 없다. 가스 흐름을 개시하고 원하는 시간에 대한 노출을 유지합니다. 램프의 균일성을 확보하기 위해 반드시노출하기 전에 가스 세척 병으로 물을 교체하십시오.
  4. 배아의 분석 생존에, 벌레가 실내 공기에 반환 후 48 H 위해 개발 수있는 시점에서 그들은 네번째 단계 애벌레 / 하루에 한 성인이어야합니다. 생존, 검열 집결 수없는 벌레를위한 점수.
  5. , hypoxia에 노출된 동물을 시각화 22mm 2 coverslip에 M9 한 방울로 벌레를 이동하고, M9 18 년 2퍼센트 아가로 오스의 패드로 바꾸란합니다. 필요한 경우, levamisole (25 ㎜)이나 나트륨 azide가 (10 ㎜) 마취제로 사용될 수있다면. 나트륨 azide와 levamisole은 독성으로 인해 일부 관측을 먹이고 수 있고 분별있게 19 사용해야합니다.

5. Hypoxia-노출된 웜 (HIF-1 양식 분석을위한 샘플의 작성 예)의 급속한 수확

많은 hypoxia - 유발 효과는 즉시 달걀 생산 12, mitotic의 epitopes의 인산화의 재개를 포함한 실내 공기에 대한 반품시 반전됩니다embryogenesis 13 HIF-1 단백질 9,20의 저하 인치 hypoxia에 노출된 동물의 신속한 격리는 이러한 조건에서 재현할 효과를 얻기 위해 필요합니다. 채 2 분 안에 설치로는, 동물 수확 수 있으며 액체 질소에 냉동. 글러브 박스 hypoxia의 챔버 anoxic 조건에서 시료의 조작을 허용하는 동안 산소 결핍 이외의 조건에 대한 자신의 비용과 실용성들의 유용성을 제한할 수 있습니다.

  1. 벌레의 과반수가 18 gravid 성인 때까지 네 10cm 고도 성장 (HG) 접시에 브리스톨 N2 벌레를 성장. 1시 5분 알칼리 표백 솔루션을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브로 벌레를 씻어 및 웜은 5 분 이상에게, 9를하지 디졸브 시작할 때까지 회전 알을 품다. 노 제동 각 세차 사이 1,500 XG에서 다운 방적, M9와 웜 세 번 씻는다.
  2. 플레이트 표백 8 150mm NGM 플레이트쪽으로 배아 및 L4 유충 (22시 브리스톨 N2 용 ~ 48시간 ° C)로 개발하기 위해 수 있습니다.환경 방으로 번호판을 이동 hypoxic (1,000 PPM, 5,000 PPM)과 4 시간 동안 anoxic (N2) 조건에 노출. 노출 시간은 실험 설계에 따라 달라집니다. hypoxia에 대한 노출이 누워 계란의 속도에 직접적인 영향을 가지고 있지만, 두 세포 배아가 노출 12 16-18시간 후에 죽어. 이 hypoxia 챔버 설정으로 노출의 낮은 한도는 평형에 도달하는 데 필요한 분위기를 교환 비율에 의해 제약된다.
  3. 분류 하나 1.5 ML의 microfuge 관과 각 실험 시료에 대해 하나 15 ML 원뿔 튜브. hypoxia에 노출된 벌레는 수확 기간 동안 튜브의 측면에 집중 가능성이 더 높습니다. 이것을 방지하기 위해 장소 각 15 ML 원뿔 튜브의 1 % 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) 100 μL. SDS는 다운 스트림 애플 리케이션을 억제하면 소 혈청 알부민은 (BSA) 집어 넣는 것을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. SDS 또는 BSA의 일상적인 사용은 명백한 차이를 가지고있다 고는 보지 않습니다. 2X 단백질 로딩 염료 (4 % SDS, 10 % 2 - 메르 캅 토 에탄올과 50 μl를 추가하십시오1.5 ML의 microfuge 튜브에 30 % 글리세롤 (W / V))에서 bromphenol 파란색으로 추적. 준비가 액체 질소의 Dewar 되세요.
  4. hypoxia와 기록에서 벌레를 제거 후 시간 단계를. , hypoxic 회의소로 뚜껑을 제거 한 샘플 접시를하고, 챔버를 다시 봉인. 15 ML 원뿔 튜브에 붓는다 후 나일론 필터에 벌레를 씻어하고 증류수를 사용합니다. 브레이크가있는 15-20초 1500 XG에 바탕 원심 분리기에 벌레를 내려 봐.
  5. 웜은 펠렛은 온전히 떠나, 튜브에서 뜨는의 대부분을 제거하는 진공을 사용하십시오.
  6. 피펫 사용하여, 1.5 ML의 microfuge 관 ~ 50 μL에 벌레 펠릿 이동합니다. 액체 질소의 튜브와 잠그다을 봉쇄해.
  7. 모든 샘플은 고립 때까지 반복합니다. 일관성을 위해 집안 공기 제어 샘플에 대해 다음 절차를 따르십시오. 샘플은 -20 ° C.에 저장될 수

6. 대표 결과

hypoxia의 Organismal 효과를 볼 수 있습니다C의 성체로 생존을 조사하여 elegans (그림 2). 야생 형 브리스톨 (N2)와 hif-1 (ia04) 삭제 돌연변이에 의해 마련 태아는 모든 집안 공기 O 2 농도 (210,000 PPM O 2)에서 생존하고 있습니다. hif-1 배아는 결혼은 안하는 동안 N이 웜은, 5,000 PPM O 2의 성인기에 적응하고 살아남을 수 있습니다. 이것은 HIF-1 환경 10에서 사용할 수있는 산소의 변화 수준에 적응을 위해 필수적임을 보여줍니다. N2도 hif-1 동물들도 1,000 PPM O 2로 노출을 살아남을 수 있습니다.

hypoxia에 직접 벌레를 떠올리 것은 해부 범위와 맑은 컨테이너 (그림 3)의 사용과 가능한 것입니다. 직접 해부 범위에서 hypoxia 챔버를 배치함으로써 organismal 반응을 관찰하는 hypoxia에서 웜을 제거 할 필요가 없습니다. 범위는 (그림 3에서와 같이 형광 illumation 들으며 수

figure-protocol-1
1 그림. 가스 유동의 Hypoxia 회의소. 방향의 예는 화살표로 표시됩니다. 가스가 정의 O 2 농도 (1) 및 두 단계 레귤레이터가 (2) 첨부되어있는 압축 가스 탱크에 저장됩니다. 가스는 정확한 유량 상단을 종료, 유동 튜브 (3)의 하단에 들어갑니다. 가스 그러면 가스 (기포를 관찰하여 버블 플라스크의 올바른 연결을 보장) 과도한 수분, 버블 플라스크 (4)으로 흐르고있다. 수산화 가스 그러면 hypoxia에 샘플을 노출, 유입 밸브 (5)에서 hypoxia 챔버로 전달합니다. 챔버에 뚫고 배기 구멍을 통해 방 안으로 가스가 드디어 통풍구.

figure-protocol-2
그림 2. 1,000 PPM O 2, 5000 PPM O에 노출된 태아의 생존 능력 2). 태아도 지속적인 흐름 산소 실에서 24 시간 동안 배아 각 산소 조건에 노출되었다. 웜은 48 시간 동안 성체로 개발할 수 normoxic 조건,로 이동 후 성체로 생존을 위해 득점했다. N> 50, N = 5.

figure-protocol-3
그림 3. C의 시각화 현미경과 hypoxia에 elegans. 벌레가 설명한 방법을 사용하여 hypoxia에 노출됩니다. 투명한 환경 챔버가 (pyrex의 결정화 접시와 유리 플레이트와 함께 건설) 해부 범위의 무대에 직접 배치됩니다. 두 의견은 전체 가스 유량을 포함 하나가 현미경의 무대에서 그냥 챔버와, 다른 설정, 표시됩니다.

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토론

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이 방법은 실험실에서 유지되는 산소의 정확한 농도가있는 환경을 허용 hypoxic 환경을 구축을위한 전략을 제시합니다. 이러한 챔버 스는 O 2의 구체적인 낮은 농도로 유기체를 노출하고 분자 및 생리 출력을 모니터링하는 간단한 방법을 제공합니다. 설명된 환경 챔버 실험실 대신 상업적으로 구입하여 조립되고 따라서 실험의 필요에 맞게 수정할 수 있습니다.

이 방법 중 하나는 뚜렷한 장점은 지속적인 흐름 디자인입니다. 이것은 일반적으로 외부 O 2 농도가 훨씬 높은 경우 (실내 공기에 210,000 PPM O 2) 실에서 O 2의 낮은 농도를 유지 함께 발생되는 어려움을 없애줍니다. 대안은 hypoxic 환경이 밀폐된 챔버에서 유지되는 중지 흐름 방식입니다. 탐지하기 어려울 수 있습니다 비록 작은 누출, 사전정지 - 흐름 방법을 사용 hypoxic 조건의 유지를 빼낼. 연속 흐름 방식은 지속적으로 압축 ...

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공개 사항

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 토론 및 원고의 비판적 읽기를 위해 밀러는 실험실의 구성원 감사드립니다. 이 작품은 DLM과 DLM에 건강 상을 R00 AG030550의 국립 연구소로 노화의 기본적인 생물의 우수의 네이선 충격 센터에서 새로운 탐정 수상에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
튜빙 (FEP와 PTFE) 콜 Parmer
Tygon 		요 - 95821-00 (1 / 8 "FEP)
06605-27 (16분의 1 X 1 / 8 "PTFE) 'R-3603
압축 피팅 시애틀 유체 시스템 06363-58 (M. 커플러 16분의 1 ")
06363-62 (F. 커플러 16분의 1 ")
06363-60 (M. 커플러 1 / 8 ")
06363-61 (F. 커플러 1 / 8 ")
유동관 알보그 PMR3-010073 (3 출력)
PMR1-013520 (1 출력)
질량 유량 제어기 시에라 인 스트 루먼트 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (질량 Trak)
C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (스마트 Trak 2)
압축 가스 탱크 AirGas 주문 제작
호스 미늘 이음쇠에 플라스틱 남성 Luer 콜 Parmer 45505-41 (500 시리즈 16분의 1 ")
아크릴 상자를 던져 Ellard 계측 주문 받아 만든
파이프 피팅 (브래스 또는 스테인리스 스틸) 시애틀 유체 시스템 B-402-1 (1 / 4 "너트)
B-200-3 (1 / 8 "유니온 티)
B-400 세트 (1 / 4 "ferrules)
B-QM2-B1-200 (QM 바디 QC)
B-200-1-2 (팔분의 일 X 1 / 8 "남성 conn)
다우 코닝 진공 그리스 시그마 - 올드 리치 Z273554
AnaeroPack 상자 Misubishi 가스 화학 회사 R684004 (0.4 리터)
R685025 (2.5 리터)
R685070 (7.0 리터)
Pyrex 가스 세척 병 시그마 - 올드 리치 CLS31770500C (500 ML)
CLS31770250C (250 ML)
CLS31770125C (125 ML)
팔미트산 시그마 - 올드 리치 P0500
염소 안티 - 마우스 IgG-양고추냉이 퍼옥시데이즈 남부 바이오 어소 시에이츠 1032-05
SuperSignal 웨스트 피코의 Chemiluminsecent 기판 피어스 화학 34,077
100 X 50 유리 결정화 요리 Kimax 킴블의 23,000

참고문헌

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