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Microfluidic 캡슐화 방법은 이전에 피코리터 규모의 수성, 단분산 방울에서 세포를 캡처하는 데 사용되어 왔으며, 고처리량 스크리닝, 세포 분석 및 질량 분석법의 응용 프로그램을 통해 벌크 유체 환경에서 제한을 제공합니다. 우리는 단일 세포를 캡슐화하는 것뿐만 아니라 설정된 수의 세포를 반복적으로 캡처하는 방법(여기서는 1세포 및 2세포 캡슐화를 시연)하여 제어된 크기의 그룹에서 세포 간의 분리와 상호 작용을 모두 연구하는 방법을 설명합니다. 입자 생성 기술과 세포 및 입자 순서를 결합함으로써 효율적이고 지속적인 캡슐화를 위해 세포 크기 입자의 제어된 캡슐화를 입증합니다. 수성 입자 현탁액과 비혼합성 플루오로카본 오일을 사용하여 흐름 집중 노즐로 오일에 수성 방울을 생성합니다. 수성 유속은 방울 생성 빈도의 정수, 다중 주파수에서 노즐에 도달하는 입자의 순서를 생성하기에 충분히 높으며, 각 방울에 제어된 수의 셀을 캡슐화합니다. 대표적인 결과를 위해 9.9μm 폴리스티렌 입자가 세포 대용으로 사용됩니다. 이 연구는 각각 39.3% 및 33.3%의 포아송 효율과 비교하여 단일 입자 캡슐화 효율 Pk=1 83.7% 및 이중 입자 캡슐화 효율 Pk=2 79.5%를 보여줍니다. 일관된 세포 및 입자 농도의 효과는 효율적인 캡슐화에 매우 중요한 것으로 입증되었으며, 드립에서 분사로의 전이도 다루어집니다.
소개
연속 배지 수성 세포 현탁액은 세포가 병렬로 상호 작용할 수 있도록 하고 배지 측정에서 특정 세포의 효과를 균질화하는 공통 유체 환경을 공유합니다. 세포를 피코리터 규모 방울로 고처리량 캡슐화하면 샘플을 제한하여 방울을 교차 오염으로부터 보호하고, 샘플 내 세포 다양성을 측정할 수 있으며, 시약 및 발현된 바이오마커의 희석을 방지하고, 바이오리액터 제품의 신호를 증폭할 수 있습니다. 또한 점안액은 점안액을 더 큰 수성 샘플로 재결합하거나 세포 간 신호 연구를 위해 다른 점안액과 재결합할 수 있는 기능을 제공합니다. 1,2 희석의 감소는 더 높은 정확도의 측정을 위한 더 강력한 검출 신호와 잠재적으로 비용이 많이 드는 샘플 및 시약 부피를 줄일 수 있는 능력을 의미합니다. 3 방울에 세포를 캡슐화하는 것은 고처리량 스크리닝을 위한 단백질 발현,4 항체,5,6 효소,7 및 대사 활성8의 검출을 개선하는 데 활용되었으며, 고처리량 세포 분석을 개선하는 데 사용될 수 있습니다. 9 추가 연구에서는 질량 분광법10 및 표적 표면 세포 코팅을 위한 방울이 포함된 세포의 바이오 전기 분무에 대한 응용 분야를 제시합니다. 11 그러나 일부 응용 분야는 방울에 캡슐화된 세포의 수를 제어할 수 있는 능력이 부족하여 제한되어 왔습니다. 여기서, 우리는 1개 및 2개의 세포에 대해 입증된 캡슐화 효율을 증가시키고 더 많은 수의 세포의 캡슐화를 위해 외삽될 수 있는 ordered encapsulation(12)의 방법을 제시한다.
단분산 방울 생성을 달성하기 위해 미세유체 "흐름 집중"을 사용하면 흐름이 수렴하는 노즐을 사용하여 다른 유체(연속 유상) 내에서 한 유체(수성 세포 혼합물)의 제어 가능한 크기 방울을 생성할 수 있습니다. 13 주어진 노즐 형상에 대해, 입자 생성 빈도 f 및 입자 크기는 오일 및 수성 유량 Q오일 및 Qaq를 조정하여 변경할 수 있습니다. 유속이 증가함에 따라 흐름은 방울 생성에서 노즐에서 수성 유체의 불안정한 분사로 전환될 수 있습니다. 14 분
수용액에 부유 입자가 포함되어 있으면 입자가 캡슐화되어 노즐에서 서로 격리됩니다. 무작위로 분포된 수성 세포 현탁액을 사용한 방울 생성의 경우, k 세포를 포함하는 방울 Dk의 평균 분율은 푸아송 통계량에 의해 결정되며, 여기서 Dk = λk exp(-λ)/(k!) 및 λ는 방울당 평균 세포 수입니다. "올바르게" 캡슐화된 방울로 끝나는 세포의 비율은 Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk')를 사용하여 계산됩니다. 두 지표 간의 미묘한 차이점은 Dk는 수성 유체의 활용 및 캡슐화 후 완료해야 하는 방울 분류의 양과 관련이 있고 Pk는 세포 샘플의 활용과 관련이 있다는 것입니다. 예를 들어, 희석된 세포 현탁액(낮은 λ)을 사용하여 세포를 포함하는 대부분의 방울이 하나의 세포만 포함하는 방울을 캡슐화할 수 있습니다. 효율성 지표 Pk는 높지만 대부분의 방울은 비어 있으므로(낮은 Dk) 빈 방울을 제거하기 위한 분류 메커니즘이 필요하고 처리량도 감소합니다. 15분
드롭 생성과 관성 순서를 결합하면 드롭당 더 예측 가능한 셀 수와 무작위 캡슐화보다 더 높은 처리량으로 드롭을 캡슐화할 수 있습니다. 관성 초점은 Segre와 Silberberg16에 의해 처음 발견되었으며 유한 크기의 입자가 채널 흐름에서 측면 평형 위치로 이동하는 경향을 나타냅니다. 관성 순서(Inertial Order)는 입자와 세포가 수동적으로 동일한 간격의 엇갈린 일정한 속도 열차로 조직되는 경향을 나타냅니다. 초점을 맞추고 정렬하려면 충분히 높은 유속(높은 레이놀즈 수)과 입자 크기(높은 입자 레이놀즈 수)가 필요합니다. 17,18 여기서 레이놀즈 수 Re =uDh/ν 및 입자 레이놀즈 수 Rep =Re(a/Dh)2, 여기서 u는 특성 유속, Dh [=2wh/(w+h)]는 유압 직경, ν는 동점도, a는 입자 직경, w는 채널 너비, h는 채널 높이입니다. 경험적으로, 완전히 정렬된 열차를 달성하는 데 필요한 길이는 Re 및 Rep가 증가함에 따라 감소합니다. 높은 Re 및Re p 요구 사항(이 연구의 경우 각각 5 및 0.5 정도)은 방울 생성 노즐에서 분사를 피하기 위해 수성 유속을 낮게 유지해야 할 필요성과 충돌할 수 있습니다. 또한 유속이 높으면 세포에 대한 전단 응력이 높아지는데, 이는 이 프로토콜에서 다루지 않습니다. 이전의 ordered encapsulation 연구에서는 이 연구에서와 유사한 흐름 조건에서 단일 캡슐화된 HL60 세포의 90% 이상이 세포막 무결성을 유지함을 보여주었습니다. 12 그러나, 전단 응력의 크기와 시간 스케일의 영향은 다른 세포 유형 및 흐름 매개변수로 외삽할 때 신중하게 고려해야 합니다. cell ordering, drop generation 및 cell viability aqueous flow rate constraints의 중복은 단일 및 다중 세포의 제어된 캡슐화를 위한 이상적인 운영 체제를 제공합니다.
입자 간 트레인 간격을 다루는 연구가 거의 없기 때문에19,20 간격을 결정하는 것은 경험적으로 가장 쉽게 수행되며 채널 기하학, 유속, 입자 크기 및 입자 농도에 따라 달라집니다. 그럼에도 불구하고, 열차 사이의 동일한 측면 간격은 세포가 예측 가능하고 일관된 시간 간격으로 도착한다는 것을 의미합니다. 정렬된 세포가 노즐에 도착하는 것과 동일한 속도로 방울 생성이 발생하면 세포는 제어된 방식으로 방울 내에 캡슐화됩니다. 이 기술은 15kHz 정도의 처리량으로 단일 세포를 캡슐화하는 데 사용되었으며,12 이는 60-160Hz 정도의 캡슐화 속도를 보고한 이전 연구보다 크게 개선된 것입니다.4,15 제어된 캡슐화 작업에서 방울의 80% 이상이 하나의 세포만 포함했으며, 이는 Poisson(무작위) 통계에 비해 상당한 효율성 향상입니다. 이는 평균적으로 40% 미만의 효율성을 예측합니다. 12세
이전의 제어된 캡슐화 작업에서12 방울 λ당 평균 입자 수는 단일 세포 캡슐화를 제공하도록 조정되었습니다. 우리는 유속의 조정을 통해 λ가 방울당 원하는 세포 수와 같거나 가까울 때 방울당 원하는 수의 세포를 효율적으로 캡슐화할 수 있다는 가설을 세웁니다. single-cell encapsulation은 자극으로부터 개별 세포 반응을 결정하는 데 중요하지만, multiple-cell encapsulation은 조절된 수 및 세포 유형의 상호 작용과 관련된 정보를 제공합니다. 여기에서는 프로토콜, 폴리스티렌 마이크로스피어를 사용한 대표적인 결과, 그리고 수동 관성 주문 채널과 방울 생성 노즐을 사용한 여러 세포의 제어된 캡슐화에 대한 논의를 제시합니다.