가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

Summary

기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.

Abstract

표면 토폴로지, 기판에 성장 세포의 예는 가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. 전지는 투명 슬라이드에 재배하고 homogeneously의 플라즈마 막에 배포 형광 마커와 incubated 수 있습니다. 조명이 사라져가는 전자기 필드의 다른 침투 깊이있는 총 내부 반사 (티르)의 변수 각도에 따라 병렬 레이저 빔에 의해 발생합니다. 10 다른 각도에서 조사시 형광 이미지의 기록은 몇 나노 미터의 정밀도로 셀 기판 거리를 계산 할 수 있습니다. 다양한 세포 라인, 예를 들어 암 세포의 정확성과 악성 세포 사이 접착력의 차이 따라서 결정됩니다. 또한, 화학 또는 photodynamic 치료시 세포 접착의 가능한 변경 사항은 검사를 할 수 있습니다. 슈퍼 해상도의 다른 방법에 비해 현미경 조명에 노출이 유지된다살아있는 세포의 아주 작은, 알 수없는 피해가 발생할 것으로 예상된다.

Introduction

굴절률 N _(1)의 중간을 통해 확산 광 빔이 굴절률 N _2의 두 번째 중간에 인터페이스를 만났을 때 1, 총 내부 반사가 중요한 각도보다 큰 발생 Θ의 모든 각도에서 발생 Θ _C = arcsin (N ₂ / N _1). 완전히 반영되지에도 불구하고 입사 광 빔은 I에 따라 두 번째 매체와 인터페이스에서 수직 거리를 Z로 기하 급수적으로 쇠퇴에 침투 사라져가는 전자기 필드를 세상의 시작과 끝 (Z) = I _{0 ^{EZ / D (Θ).}} I (z는) 등으로 주어진 파장 λ의 침투 깊이로 전자 분야와 D (Θ)의 강도에 해당

D (Θ) = (λ/4π) (N ₁ ² 죄가 ^두 Θ - N _{² 2)} ^{-1 / 2}

문학 ^{1,2에보고로서,} ₀ 는 I _이메일이 전송 요소 T (Θ) 및 비율 N ₂ / N ₁ 곱한 입사광의 강도에 해당합니다. 이 광 빔의 전기장 벡터가 입사 평면 (사건과 반사 빔이 사라지는 비행기 IE)에 편광 수직 인 경우,이 전송 요소가 주어집니다

T (Θ) = 4 ^{왜냐하면이} Θ / [1 - (N ₂ / NL ₁₎ ^2]

TIRFM 측정에서 검출 된 형광 강도를 들어, 광 흡수는 시료의 모든 레이어를 통해 통합과 관련 염료의 형광 양자 수율 η로뿐만 아니라 감지 Ω의 고체 각도 곱해야합니다. 이전에 ^3보고,이 강도는에 의해 설명 될 수있다

I _F (Θ) = (Θ) OC (Z) AT ^{전자 Z / D (Θ)} dz

경우 독립적 인 F있는 모든 요소 fluorophores의 농도 C (Z)이 거의 일정으로 간주되는 경우 ROM이 입사 각도 Θ과 좌표 Z는 실험 상수 A. 방정식 3에서 포함되어 있습니다이 analytically 해결 될 수

- 중 모든 좌표 Z ≥ Δ에서 인터페이스에서 거리 Δ을 갖는 세포의 세포질 내에서 지정할 수있다. 이 경우 적분은 Z = Δ부터 Z = ∞ 결과 계산해야합니다

I _F = C T (Θ) D (Θ) ^{E-Δ / D (Θ)}

- 또는 Z 사이 = Δ - t / 2, Z = Δ + t / 2, 두께 t의 얇은 층 내에서 즉, 예를 들어 인터페이스에서 거리 Δ에있는 세포막. 이 경우 형광 강도는 다음과 같이 계산 될 수있다

I _F = C T (Θ) ^{테-Δ / D (Θ),}

t는 Δ에 비해 작은 경우.

형광 강도 I _F의 이미지가 변수 각도에 기록하는 경우 방정식 (4)와 (5) 셀 기판 거리에서 다닐 ">는 Δ는 계산 될 수있다 Θ 있으며, 경우 후면 (I _F / T D) (Eq. 4) 또는 후면 (I _F / T) (Eq. 5) 이러한 각도 1 / D의 함수로 계산됩니다.이 문서에 사용 된 막 마커 laurdan (S. 아래)에 대한 평가가 EQ 5.에 따라 수행되었다.

이전 ^3, 이미지 수집보고 및 평가가 필요로
- 샘플을 여기 빛의 균일 한 분배,
- 2 층 모델 (기판과 세포질의 굴절 지수 N _1과 N _2, 각각)의 타당성. 플라즈마 막가 매우 얇은 경우이 보유하고 있으며, 세포 매체 (셀과 기판 사이)의 층은 입사광의 파장에 비해 작은 경우.

또한, 중간 수치 개구(일반적으로 ≤ 0.90) 현미경 대물 렌즈의는 유전체 인터페이스의 가까운 분야에서 방사선의 이방성에 의한 밝기의 편차를 방지하기 위해 바람직하다.

Protocol

1. 셀 심는과 부화

1. 시드 개별 세포, 예를 들어 U373-MG 나 U-251-MG의 glioblastoma 세포 유리 슬라이드에 100 세포 / mm ^2의 전형적인 밀도와 (예 : RPMI 1640 10% 태아 송아지 혈청 보충 문화 매체에서 4,872 시간을 위해 성장 37에서 보육을 사용하여 항생제) ° C 5 % CO _2.
2. 막 마커, 예를 들어 6 dodecanoyl-2-디메틸 아미노 8 μM (문화 매체)를 ⁴ 또는 세포질 표시의 농도에서 60 분 신청 나프탈렌 (laurdan)는, 예를 들어 calcein acetomethlyester은 40 분 신청과 함께 세포를 배양 ^4,5, 5 μM ³ 또는 photosensitizer 관련된 멤브레인의 농도는, 예를 들어 protoporphyrin IX는 전구체 5 aminolevulinic 산 (1 MM 5 알라)는 4 시간의 부화에 유도.
3. 문화 중간이나 인산염으로 세포를 씻어 염분 (PBS)는 형광 현미경하기 전에 버퍼. <이/ 리>

2. VA-TIRFM

1. 수직 현미경, 예를 Zeiss Axioplan를 사용하여 참조에 설명 된대로, 조명 장치에 의해 그것의 콘덴서를 교체하십시오. 헤미 - 구형 또는 광학 (그림 1 참조) 객체 슬라이드에 커플 링 된 헤미 - 원통형 유리 프리즘과 3.
2. 병렬 평형 레이저 빔을 사용하는 유리 프리즘 다시 추가로 광학 부품 (예 : 오목 거울) 샘플의 표면 (텔레 센 트릭 학생 선)에 평행 빔의 결과로 이미징 후. 전기장 벡터가 입사 평면에 수직 편광 것을 조심하고.
3. 샘플면에서 이미징 및 발생의 변수 각도 (개체 레이)에서 샘플을 조명하는 콘덴서 내부에 위치한 조절 미러를 사용합니다. 각 위치 입사 잘 정의 된 각도에 해당하는 곳 goniometric 측정 ³ 결정으로 조절 거울은, 단계 모터에 의해 구동 될 수있다 >를 논의하게 될 것입니다.
4. 중요한 각도를 사용하여 조절 미러의 각도 위치를 보정 Θ _C = 61.3 ° 고정 값으로 유리 물 전환을위한. Θ _C는 형광 염료 (예 : 1 ㎜ 플라 빈의 mononucleotide, FMN)가 물에 용해되어 Θ의 변화에 따라 시각화 할 수 있습니다. 에서 거울의 위치 Θ = Θ _C 미러 위치 프로그램에 저장됩니다.
5. 온도, 이득, 녹화 시간과 이동 속도를 포함하여 카메라의 매개 변수를 (다시 조명 ANDOR Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR 기술, 벨파스트, UK ^6)으로 설정합니다.
6. 적절한 배율과 우선적으로 적당한 숫자 개구 (예 : 40 × / 0.75 또는 63 × / 0.90 물 침적)의 목적 렌즈를 사용하고 현미경의 객체 슬라이드를 현지화. 유리 프리즘과 샘플의 광학 접촉을 보장하기 위해 집중 오일을 사용합니다. 의 변화에​​ 따라 동일한 샘플의 형광 이미지를 기록조명의 각도 (Θ ≥ Θ _C Θ와 _C 셀 유리 인터페이스 64.5 °에 해당). 0.5 ° 또는 1 °의 단계를 66 ° -74 °의 각도 범위를 권장합니다. 형광 검출에 적합한 긴 패스 또는 밴드 패스 필터를 사용합니다.

3. 데이터 분석

1. 다양한 각도 Θ뿐만 아니라 카메라 설정 (배경 차별에 대한), 여기 파장과 유리의 굴절 지수 (= 1.52 N ₁₎ 셀에 기록 된 이미지를 (ASCII 형식으로 예를 들어) (N ₂ = 1.37) 읽기 평가 프로그램에 (LabView, NanoCell). 에 대한 매개 변수 침투 깊이 D (Θ)와 전송 계수 T (Θ)의 각 집합이 자동으로 계산됩니다.
2. 수식 5 (막 마커) 또는 수식 4 (세포질 마커), inhomogeneous있는 개별 이미지에 따라 Δ 셀 기판 거리의 평가에 사용되는 이미지를 선택조명 (누설 E, G. 줄무늬)이 제외 될 수 있습니다.
3. 셀 기판 토폴로지의 이미지를 계산 및 디스플레이에 적합한 색상 코드를 선택합니다. 도 2에 도시로 개별 픽셀의 평가 프로파일 동안은 표시 할 수 있습니다. 이 프로필은 피팅의 품질에 대한 지표로 사용할 수 있습니다.
4. 평가 프로토콜을 저장합니다.

4. 대표 결과

대표 실험은 친절 교수 월 Mollenhauer, 분자 종양학학과, 남부 덴마크 대학, 오덴세 (Odense)가 제공하는 유전 공학 U251-MG의 glioblastoma 세포를 수행하고 있습니다. 그 U251 세포의 두 subclones에서 종양 억제 유전자 TP53 또는 PTEN이 사용하는 오버 표현됩니다 Tet-에 inducible 표현 시스템이 세포가 감소 tumorigenic 잠재력을 전시하고 더 악성으로 간주 될 수 있다는 등.주세요 억제 유전자가없는 높은 악성 U251-MG 세포는 컨트롤로 사용하고, U251-아르MG 야생 형 세포는 더 비교 제공합니다. picosecond 펄스의 준 연속 시리즈 (; 391 나노 미터, 펄스 에너지 : 12 PJ, 반복 속도 : 파장 드라이버 PDL 800-B, Picoquant, 베를린, 독일과 LDH400 40 MHz의) 배출 레이저 다이오드는 여기 소스로 사용됩니다.

그림에서 활성 TP53 종양 억제 유전자로하고 laurdan (8 μM, 60 분)와 incubated U251-MG의 glioblastoma 세포의 3 TIRFM 이미지는 66.0 °의 입사 각도 69.0 °와 73.0 °의 침투 깊이에 해당하는에 그려져있다 약 140 nm의 사라져가는 전자기 분야, 75 nm의 60 nm의, 각각. 침투 깊이 형광을 감소와 함께 강도 감소 (비늘 참조) 세포의 더 많은 외면 사이트 (자신의 가장자리에 예를 들면 초점 연락처)에서 유래 된 것입니다. 셀 - 기판 거리가 (0-600 나노 미터 사이 인 색상 코드로 그림 3D로 시각화) 강력에 간 세포를 통해 다양통증이 몇 나노 미터 (흰색 - 노란색)과 250-300 nm의 (어두운 빨강), 즉 초점 연락처 및 큰 셀 기판 거리가 가까운 근처에 있습니다. 그림 4B, 셀 기판 거리가 U251-MG 제어 및 80-100 nm의 전형적인 값으로 야생 형 세포 (노란색에 오히려 상수를하는 동안 동일한 활성 억제 유전자 PTEN (그림 4D)와 U251-MG의 glioblastoma 세포에 대한 보유 )과 150-200 nm의 (오렌지 레드,도 4a).

그림 1. 직립 현미경의 VA-TIRFM을위한 조명 장치. 단계 모터에 의해 구동 조절 거울은 ± 0.25 °의 각도 해상도를 할 수 있습니다.

한 PIX에 대한 그림 2. 평가의 프로필엘 (설계도). 언제 에선 [I _F / T (Θ)]는 1 / D (Θ)의 함수로 도시된다, 경사가 셀 - 기판 거리 Δ를 나타냅니다. 이 경사는 일반적으로 약 정밀 ± 10 %로 결정된다. 한 값은 - inhomogeneous 조명으로 인한 - 표시 및 평가에서 제외되었습니다.

그림 3 laurdan (8 μM, 60 분)와 부화시 활성 TP53 억제 유전자와 U251-MG의 glioblastoma 세포의 TIRFM 이미지를 표시합니다. 조명의 다양한 각도 (AC)로 기록, 0-600 nm의 범위에서 셀 기판 거리가 게재 391 나노 미터, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 : 여기 파장, 색상 코드 (D)에 의해. 210 μm × 210 μm은 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4 색 코드에 의해 표시 0-600 nm의 범위에서 U251-MG의 glioblatoma 전지의 셀 - 기판 거리,. () 야생 유형 (B) 컨트롤, 활성 억제 유전자 TP53와 (C) 전지, (D) 활성 억제 유전자 PTEN과 세포, 여기 파장 : 391 nm의, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 :. 210 μm × 210 μm은 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

방법은 나노 미터 정밀도와 셀 기판 거리를 측정하기위한 설명되어 있습니다. 현재, 슈퍼 해상도 현미경의 방법은, 예를 들어 구조화 된 조명 ^{7 일} 또는 단일 분자 검출 ^8-10뿐만 아니라 자극 방출 고갈 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 현미경 ¹¹ 상당한 관심을 끌 수있는을 기반으로합니다. 이러한 기술 중 어느 것도 그러나, 50 nm의 아래 축 해상도를 허용하지 않습니다. 또한, 50,100의보다 높은 방사는 W / cm ^2도 전혀 두려움을 모르는 강인한 현미경위한 단일 분자 방법과 3,000여 W / cm ^2가 필요합니다. 이러한 문제가 발생할 가능성이 크기의 여러 명령, 살아있는 세포에 있도록 빠른 손상에 의해 (MW / cm 100 ²⁾ 태양 복사를 초과합니다. VA-TIRFM 실험에서, 그러나, 조사량은 세포 ¹² 생활에 악영향없이 몇 분 또는 시간의 노출 시간을 허...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	유형	코멘트
보육기	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
층류	안전 Holten	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신	BIOCHROM		재배 매체
유리 객체 슬라이드	Marienfeld	순수 흰색 유리	사용되는 특별한 청소 절차
6 - dodecanoyl-2-디메틸 아미노 나프탈렌 (laurdan)	분자 프로브		형광 마커 (증권 솔루션 : 에탄올 2 ㎜)
현미경	칼 Zeiss	Axioplan 1
레이저 다이오드	PicoQuant	드라이버 PDL 800-B와 LDH 400	파장 : 391 nm의
단일 모드 광섬유 시스템	포인트 소스	kineFlex	collimating 광학와 함께 사용
EMCCD 카메라	ANDOR	DV887DC	다시 조명 카메라