가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

Summary

기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.

Abstract

표면 토폴로지, 기판에 성장 세포의 예는 가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. 전지는 투명 슬라이드에 재배하고 homogeneously의 플라즈마 막에 배포 형광 마커와 incubated 수 있습니다. 조명이 사라져가는 전자기 필드의 다른 침투 깊이있는 총 내부 반사 (티르)의 변수 각도에 따라 병렬 레이저 빔에 의해 발생합니다. 10 다른 각도에서 조사시 형광 이미지의 기록은 몇 나노 미터의 정밀도로 셀 기판 거리를 계산 할 수 있습니다. 다양한 세포 라인, 예를 들어 암 세포의 정확성과 악성 세포 사이 접착력의 차이 따라서 결정됩니다. 또한, 화학 또는 photodynamic 치료시 세포 접착의 가능한 변경 사항은 검사를 할 수 있습니다. 슈퍼 해상도의 다른 방법에 비해 현미경 조명에 노출이 유지된다살아있는 세포의 아주 작은, 알 수없는 피해가 발생할 것으로 예상된다.

Introduction

굴절률 N _(1)의 중간을 통해 확산 광 빔이 굴절률 N _2의 두 번째 중간에 인터페이스를 만났을 때 1, 총 내부 반사가 중요한 각도보다 큰 발생 Θ의 모든 각도에서 발생 Θ _C = arcsin (N ₂ / N _1). 완전히 반영되지에도 불구하고 입사 광 빔은 I에 따라 두 번째 매체와 인터페이스에서 수직 거리를 Z로 기하 급수적으로 쇠퇴에 침투 사라져가는 전자기 필드를 세상의 시작과 끝 (Z) = I _{0 ^{EZ / D (Θ).}} I (z는) 등으로 주어진 파장 λ의 침투 깊이로 전자 분야와 D (Θ)의 강도에 해당

D (Θ) = (λ/4π) (N ₁ ² 죄가 ^두 Θ - N _{² 2)} ^{-1 / 2}

문학 ^{1,2에보고로서,} ₀ 는 I _이메일이 전송 요소 T (Θ) 및 비율 N ₂ / N ₁ 곱한 입사광의 강도에 해당합니다. 이 광 빔의 전기....

Protocol

1. 셀 심는과 부화

1. 시드 개별 세포, 예를 들어 U373-MG 나 U-251-MG의 glioblastoma 세포 유리 슬라이드에 100 세포 / mm ^2의 전형적인 밀도와 (예 : RPMI 1640 10% 태아 송아지 혈청 보충 문화 매체에서 4,872 시간을 위해 성장 37에서 보육을 사용하여 항생제) ° C 5 % CO _2.
2. 막 마커, 예를 들어 6 dodecanoyl-2-디메틸 아미노 8 μM (문화 매체)를 ⁴ 또는 세포질 표시의 농도에서 60 분 신청 나프탈렌 (laurdan)는, 예를 들어 calcein acetomethlyester은 40 분 신청과 함께 세포를 배양 ^4,5, 5 μM ³ 또는 photosensitizer 관련된 멤브레인의 농도는, 예를 들어 protoporphyrin IX는 전구체 5 aminolevulinic 산 (1 MM 5 알라)는 4 시간의 부화에 유도.
3. 문화 중간이나 인산염으로 세포를 씻어 염분 (PBS)는 형광 현미경하기 전에 버퍼. <이/ 리>

2. VA-T....

Discussion

방법은 나노 미터 정밀도와 셀 기판 거리를 측정하기위한 설명되어 있습니다. 현재, 슈퍼 해상도 현미경의 방법은, 예를 들어 구조화 된 조명 ^{7 일} 또는 단일 분자 검출 ^8-10뿐만 아니라 자극 방출 고갈 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 현미경 ¹¹ 상당한 관심을 끌 수있는을 기반으로합니다. 이러한 기술 중 어느 것도 그러나, 50 nm의 아래 축 해상도를 허용하지 않습니다. 또한, 50,100의보다 높은 방사는 W / cm ^2도 전혀 두려움을 모르는 강인한 현미경위한 단일 분자 방법과 3,000여 W / cm ^2가 필요합니다. 이러한 문제가 발생할 가능성이 크기의 여러 명령, 살아있는 세포에 있도록 빠른 손상에 의해 (MW / cm 100 ²⁾ 태양 복사를 초과합니다. VA-TIRFM 실험에서, 그러나, 조사량은 세포 ¹² 생활에 악영향없이 몇 분 또는 시간의 노출 시간을 허.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	유형	코멘트
보육기	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
층류	안전 Holten	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신	BIOCHROM		재배 매체
유리 객체 슬라이드	Marienfeld	순수 흰색 유리	사용되는 특별한 청소 절차
6 - dodecanoyl-2-디메틸 아미노 나프탈렌 (laurdan)	분자 프로브		형광 마커 (증권 솔루션 : 에탄올 2 ㎜)
현미경	칼 Zeiss	Axioplan 1
레이저 다이오드	PicoQuant	드라이버 PDL 800-B와 LDH 400	파장 : 391 nm의
단일 모드 광섬유 시스템	포인트 소스	kineFlex	collimating 광학와 함께 사용
EMCCD 카메라	ANDOR	DV887DC	다시 조명 카메라