세포 기능에 microenvironments의 분자 구성의 영향에 통찰력을 얻기위한 조합 기능 검사 방법을 설명합니다. 방법은 세포 접착 및 기능 분석을 지원하는 정의 조합 microenvironments의 배열을 생성하기 위해 기존의 microarray 기반 기술을 활용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포와 주변 microenvironment 사이의 상호 작용은 세포의 행동에 기능 결과가 있습니다. 단일 세포 수준에서 독특한 microenvironments는 차별화, 마이그레이션 및 확산 phenotypes을 부과 할 수 있으며, 조직 수준에서 microenvironment는 morphogenesis와 tumorigenesis 일처럼 복잡한 처리합니다. 만 내 microenvironments 영향 세포의 세포와 분자 내용을했지만 때문에 탄성 2, 조직의 구조 3 할 수 없습니다. 셀 - 셀, - ECM, 및 가용성 요소 상호 작용의 합으로 정의, 물리적 특성뿐 아니라, microenvironment가 복잡합니다. 조직 내에서 세포의 phenotypes는 게놈 콘텐츠 및 microenviroment과 조합 상호 작용에 부분적으로 인해 부분적으로 인해 수 있습니다. 주요 과제는 독특한 행동과 microenvironmental 구성 요소의 특정 조합을 연결하는 것입니다. 다닐 "> 여기에서, 우리는 조합 microenvironments 4 상호 작용의 셀 기반의 기능 검사에 대한 microenvironment microarray (MEArray) 플랫폼을 제시한다. 방법은 분자의 조성과 탄성 계수의 동시 제어 할 수 있으며, 널리 사용 가능한 microarray의 사용을 결합 그리고 micropatterning 기술. MEArray 화면 그러한 성인 전구 세포와 같은 희귀 한 세포 유형의 기능 연구를 용이하게 배열 10,000 세포처럼 몇이 필요합니다. 기술의 한계는 전체 조직 microenvironments이 완전히 MEArrays에 recapitulated 할 수 있습니다.의 그러나, 비교 수많은 관련 microenvironments에 동일한 셀 유형의 응답 예를 들어 특정 조직을 특징 ECM 단백질의 pairwise 조합, microenvironmental 구성 요소가 조직 별 기능 phenotypes을 이끌어내는 방법에 통찰력을 제공 할 것입니다.
MEArrays는 재조합 촉진제 다양한을 사용하여 인쇄 할 수 있습니다wth 요인 크린 시토 킨 및 정화 ECM 단백질, 그리고 그 조합. 플랫폼은 특정 시약의 가용성에 의해 제한됩니다. MEArrays 시간은 실효 분석 의무가 있지만, 대부분 형광 프로브와 measureable 아르 세포 기능의 엔드 포인트 분석에 사용됩니다. 예를 들어, DNA 합성, apoptosis, 차별화 된 국가의 수집, 또는 특정 유전자 제품의 생산은 일반적으로 측정합니다. 간단히, MEArray 실험의 기본 흐름이 인쇄 substrata으로 코팅 슬라이드를 준비하고 인쇄 할 아르 단백질의 마스터 판을 준비하는 것입니다. 그런 다음 배열은 microarray 로봇과 함께 인쇄되어, 세포는 첨부 문화에 성장하고 화학적 실험 엔드 포인트에 도달시 고정 할 수 있습니다. 기존의 현미경이나 microarray 스캐너와 이미징 형광 또는 colorimetric assays은, 관련 분자 및 세포 phenotypes (그림 1)을 공개하는 데 사용됩니다.
프로토콜
1. 인쇄 Substrata 준비
(PA) polydimethylsiloxane (PDMS) - 코팅 또는 polyacrylamide - 코팅 슬라이드를 사용하는 결정은 실험 설계의 중요한 매개 변수에 따라 달라집니다. 두 고분자의 탄성 계수는 PDMS의 기본 / 치료 비율 및 PA의 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 비율을 변경하여 다른 조직의 강성을 모방하도록 설계 할 수 있습니다. PDMS은 1 10MPa (예 연골, 각막, 그리고 동맥 벽)의 범위에서 엄격한 조직을 모방 할 수 있으며, PA는 100Pa-100kPa (예 : 유방암, 뇌, 간, 전립선) 5의 범위에서 부드럽고 조직을 모방 할 수 있습니다. PDMS는 준비, 저렴한 간단하고, 인쇄 기능의 형상은 인쇄 핀의 머리에 동일해야합니다. 따라서 기능의 크기와 모양은 정확하게 다른 팁 구조와 핀을 사용하여 제어 할 수 있습니다. PDMS는 세포 처리 및 immunos 동안 몇 가지 문제의 원인이되는, PA보다 더 소수성입니다단계를 taining, 그리고 일부 세포 라인과 호환 될 수 있습니다. PA는 히드로 겔과 기본 비 오염 표면이기 때문에, 세포는 지원하는 세포 접착 단백질이 있습니다 명소에 연결합니다. PA의 젤에....
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토론
여기에 제시된 MEArray 방법은 셀 및 조합 microenvironment의 상호 작용 4 기능 분석을 할 수 있습니다. MEArray 분석은 기본 micropatterning 기술, 세포 생물학, 및 microarray 인쇄 로봇과 많은 다중 시설에서 사용할 수있는 분석 기기의 사용이 조화를 이루고 있습니다. 혈청이없는 미디어 공법은 첨부 파일을 향상시킬 수 BSA 또는 <1 %의 혈청을 포함하는 경우에 조정해야 할 수도 있지만 MEArray 화면은 가장 자기편 세포 유형과 호환됩니다. 이 방법은 특정 세포의 기능을 분석 시약의 가용성에 의해 제한됩니다, 형광 기반 assays는 배열 기반의 대부분의 이미징 시스템과 호환됩니다하지만, colorimetric의 assays는 잘 작동 할 수 있습니다. 이 방법의 다른 변형은 복잡한 microenvironments이 기능 개인 microenvironment 분자와 조합 그 세포 func의 다양한에서 재생 어떤 역할을 나타 내기 위해 해부 할 수있는 일.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
ML은 NIA (R00AG033176 및 R01AG040081)와 실험실 감독 연구 및 개발, # DE-AC02-05CH11231 에너지 계약의 미국과로 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| 유리는 25mm X 75mm를 슬라이드 | VWR | 48311-600 | |
| 유리 coverslips (제 1) 24mm X 50mm | VWR | 48393-241 | |
| 착색 요리 (또는 Coplan 병) | VWR | 25461-003 | |
| 배양 접시 (15 ㎝) | BD 팔콘 | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | 시그마 - 알드리치 | S2567 | |
| 원숭이 (> 98% (3-Aminopropyl) triethoxysilane) | 시그마 - 알드리치 | A3648 | |
| 글 루타 알데히드 | 시그마 - 알드리치 | G7651 | 물 50 % |
| APS (> 98 % 암모늄 Persulfate) | 에스igma - 올드리치 | A3678 | ddH 2 O와 10% 작업 솔루션을 준비 |
| TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethylenediamine) | 시그마 - 알드리치 | T9281 | |
| 아크릴 아미드 (40 %) | 시그마 - 알드리치 | A4058 | |
| 비스 - 아크릴 아미드 (2 % w / V) | 피셔 BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm의 주사기 필터 4 mm 나일론 | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | 시그마 - 알드리치 | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | 다우 코닝 | 3097358-1004 | 엘스 워드 접착제를 통해 Sylgard 184 엘라스토머 키트 |
| 2 챔버 슬라이드 | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| 궁금 하네arium 밀봉 | 다우 코닝 | DAP 00,688 | |
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참고문헌
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage spe....
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재인쇄 및 허가
