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방법 논문

제조 및 레이저 조직 복구에 장미 벵골 - 키토산 영화의 응용

11.9K 조회수

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DOI:

10.3791/4158

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2012년 10월 23일

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1Bioelectronics and Neuroscience (BENS) research group, University of Western Sydney, NSW Australia, 2Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, NSW Australia, 3School of Medicine, University of Siena, Italy

이 논문에서

요약

봉합은 일반적으로 수술 절차 동안 조직을 복구 할 필요합니다. 그들은 침략하고 조직에 손상을 줄 수 있으므로 그러나, 그 응용 프로그램은 문제가 될 수 있습니다. 소설 조직 접착제의 제조 및 응용 방법이 여기에보고됩니다. 이 접착제 필름은 레이저 활성화되고 봉합의 사용을 필요로하지 않습니다.

초록

광화학 조직 접합 (PTB)는 두 조직 가장자리 1,2 사이에 장미 벵골 (RB)의 솔루션을 적용하여 달성 조직 수리에 대한 sutureless 기술입니다. 이 그 다음 선택적으로 RB에 의해 흡수되는 레이저로 했소 있습니다. 그 결과 광화학 반응은 아마도 최소한의 열 생산 3 조직의 콜라겐 섬유를 crosslink. 이 보고서에서, RB는 레이저 활성화되어 새로운 조직 접착제를 조작하는 얇은 키토산 필름에 통합되었습니다. 키토산 및 ~ 0.1 중량 %의 RB를 포함에 따라 접착제 필름, 고체 상태 레이저 (λ = 532 nm의, Fluence ~ 110 J / cm 2, 스폿 사이즈 ~ 0.5 cm)에 의해 제조와 종아리 소장과 쥐 정강 신경에 접착 아르 . 개인용 컴퓨터와 인터페이스 단일 열 tensiometer은, 접합 강도를 테스트하는 데 사용됩니다. 15 세기 ± 6 kPa (N = 30)와 단단히 장에 RB-키토산 접착제 채권. 접착 강도는 2 &까지 떨어plusmn, 2 kPa (N = 30) 레이저가 접착제에 적용되지 않을 때. 정강 신경의 문합은 봉합를 사용하지 않고 완료 할 수 있습니다. 소설 키토산 접착제는 해당 채권이 photochemically 조직에 가공되​​어 봉합이 필요하지 않습니다.

프로토콜

1. 키토산 접착제 준비

  1. 키토산 분말은 아세트산 용액에 용해이다; 아세트산 (2 % V / V)의 주식 솔루션의 준비를 위해, 490 ML 탈 이온수 (DI-H 2 O)로 10 ML 빙하 아세트산을 추가합니다.
  2. 아세트산의 장미 벵골 (RB) (0.01 % w / V)의 주식 솔루션의 준비를 들어, photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일로 싼 병에 RB의 5 밀리그램 무게. 아세트산 주식 솔루션 (섹션 1.1에 설명)의 49.5 ML을 추가 한 후 분말을 용해하는 DI-H 2 O의 0.5 ML를 추가합니다.
  3. 키토산 용액 (1.7 % w / V)의 준비를 위해, 키토산 분말 (중간 MW, 아세틸의 85 % 정도)의 0.85 g을 무게 RB 아세트산의 산성 솔루션의 50 ML에 추가 할 수 있습니다. 컨트롤은 RB없이 아세트산 용액에 키토산을 용해하여 준비되었다.
  4. 키토산 혼​​합물에 자석 교반기를 추가하고 실온에서 젓는다. 구성 요소의 완전한 해산을 보장하기 위해, 키토산을 흔들어2 주 5 일 아세트산의 키토산 (제어)에 대한 아세트산의 + RB. 키토산을 용해되면 솔루션 pH는 2.6 ~ 3.9에서 ~까지 증가합니다. RB는 산성 pH의에서 제대로 용해하고 그 용액의 pH 및 용해 할 수있는 확장 저어 시간의 증가가 필요합니다.
  5. 1 시간에 3,270 XG에서 솔루션을 원심 분리기와 예를 들어, 멸균 10 ML의 주사기 사용하여 표면에 뜨는를 수집합니다. 불순물 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. 이 단계 동안, 솔루션은 매크로 불순물과 불용성 물질에서 청소 서비스가 제공됩니다.
  6. 멸균 주사기를 사용하여 평면 perpex 판에 (centrifuged) 키토산 용액을 주사. 건조 필름의 두께는 솔루션의 투여 량과 솔루션 확산되는 동안 표면 영역 사이의 비율에 따라 달라집니다. 솔루션은 기포의 무료이며 고르게 슬래브에 퍼져 있는지 확인합니다. ~ 13 μm의 두께로 박막을 구하려면 12cm이 표면에 ~ 1 ML 솔루션을 주입영역 (크기가 ~ 3x4 cm, 그림 1A).
  7. 솔루션의 photobleaching 피하기 위해 예를 들어 알루미늄 호일로 만든 화면 Perspex 판을, 다룹니다. 공기가 충분히 환기가 화면 아래에있는 솔루션을 건조 보장되어 있는지 확인하십시오.
  8. 그 결과 영화는 물에 불용성이며, macroscopically 팽창하지 않습니다 때까지 실내 온도 (25 ° C)와 압력 (1 ATM)에서 건조 할 수있는 솔루션을 둡니다. 이것은 일반적으로 2 주에 달성된다.
  9. 조심스럽게 얇고 평평한 주걱을 사용하여 필름을 분리 :이 필름은 쉽게 손상시키지 않고 Perspex 슬래브에서 벗겨 수 있습니다.
  10. 마이크로 미터를 사용하여 필름의 두께를 측정합니다.
  11. 깨끗한 날카로운 가위로 사각형 스트립에 접착제를 잘라과 평면 모양을 유지하기 위해 멸균 유리 슬라이드 사이에 넣어. 빛 차폐 용 알루미늄 호일에있는 슬라이드를 정리하고 실온에서 보관하십시오. 또는 "키토산 adhes"접착제 장미 "로 RB와 함께 또는없이 접착제 레이블을필자 "각각.
  12. 이 접착제 필름은 감마 방사선 (0.1 KGy / 24 시간 용 H) 4,5이나 (90 %) 에탄올을 사용하여 소독 할 수 있습니다 올랐다.

2. 접착제 광 감쇠

  1. 석영 큐벳 안에 장미 접착제를 해결했습니다.
  2. 이중 빔 분광 광도계 4를 사용 800 nm의 - 400의 범위에서 해당 감쇠 스펙트럼을 기록합니다.
  3. 다음과 같이 맥주의 율법의 유효성 가정, 접착제의 감쇠 길이를 계산 : I = I 0 전자 도끼 어디 0 입사 빔 강도, 1 / A는 감쇠 길이이며, 여기서 x는 필름 두께입니다.
  4. 키토산 접착제에 대한 2.1-2.3가 컨트롤 역할을하는 단계를 반복합니다.

3 체외 응용 프로그램에서 :. 소장에 레이저 조직 본딩

  1. 수확 종아리 소장은 즉시 후 -80 동물 안락사 및 매장 ° C.
  2. 사용하기 전에, 녹이과 수화물 트레져 아일랜드10 분 동안 DI-H 2 O에 immersing하여 ssue.
  3. 운영 현미경 (X10)에서 # 10 블레이드를 사용하여 섹션 (2 × 1 ㎝)로 조직을 이등분. DI-H 2 O를 사용하여 섹션 습기를 유지
  4. (끝과 끝) 가까운 곳에 절개를 stumps 가져와. 면 팁을 사용하여 표면에서 초과 물을 닦아주십시오.
  5. 장 (그림 2)와 전체 접촉을 보장 microforceps로 serosa 층에있는 절개를 통해 장미 접착제 스트립 (10 × 6 ㎜) 놓습니다.
  6. 장미 접착제의 조직 유착은 멀티 광섬유 (코어 직경 200 μm) 4에 커플 링 다이오드 펌핑 고체 레이저에 의해 활성화됩니다.
  7. 180 MW에 레이저의 전력 수준을 설정하고 표 1에 나와있는 매개 변수를 사용 ~ 5 mm의 빔 스폿 크기 ~ 6 분, 대한 접착제를 비추다. 스팟 - 비추다 접착제는 각 지점이 인접 지점으로 빔을 이동하기 전에 ~ 5 초 동안 방사선 것을 보장합니다. 티그 과정은 레이저 빔은 접착제 여러 번 전체 면적을 검색하는 보장합니다.
  8. 조직 접합 강도를 평가하기 위해, 기계 그립을 사용하여 보정 한 열 tensiometer (Instron, MA, USA)에 샘플을 클램프. 네 별도의 두 조직 stumps까지 22mm / 분에서 그립을 이동합니다.
  9. 단계 3.5에 설명 된대로 조직의 장미 접착제를 놓습니다. 샘플을 비추다과 단계 3.8에 설명 된대로 조직 접합 강도를 측정하지 마십시오. 이 예제는 제어 역할을합니다.

4 생체 응용 프로그램에서 :. 정강 신경 문합

  1. O / isoflurane이 혼합물 (이후 유도 동안 4퍼센트, 2 %) 5 품위 Wistar 쥐. 피하 간 수술 진통제 활동을 제공하고 가능한 통증이나 불편 함을 완화하기 위해 Buprenex를 (0.03 밀리그램 / kg) 주입.
  2. 다음 수술 절차는 운영 현미경 (X10)에서 수행해야합니다. 경사 피부 만들기오른쪽 허벅지의 dorso - 측면 부분의 길이 둔부 근육이를 통해 근육 분할 방식으로 정강 신경을 노출 3cm에 대한 절개.
  3. 부분적으로 해부하고 바로 마이크로 가위를 사용하여 정강 신경의 adventitia을 다듬하고 멸균 거즈 나면 팁을 초과하는 물을 흡수합니다.
  4. 마이크로 가위로 정강 신경을 잘라 요.
  5. 마이크로 포셉을 사용하여 정강 신경 아래에 살균 키토산 스트립 (크기 5 X 4mm)을 배치합니다.
  6. 대략적인 신경 stumps 장미 접착제 스트립 이상의 마이크로 포셉과 엔드 - 투 - 엔드.
  7. 스트립 완전히 스트립의 레이저 조사 동안 신경의 회전을 도와드립니다 칼라를 형성 신경을 준수합니다.
  8. ) 단계 3.6에 설명 된대로이 레이저 접착제를 장미 활성화) 및 3.7.
  9. 작동 신경의 칼라에서 중복 장미 접착제를 잘라.
  10. 다섯 3-0 봉합 5 근육과 피부를 닫습니다.
  11. 필요한 경우 표준 수술 복구 절차는 dehiscence 또는 고름 형성과 진통제 관리에 대한 일일 점검 등의 준수해야합니다.

5. 대표 결과

얻을 수있는 영화는 밝고은 색 장미 얇고 매끄러운 표면 (그림 1)가 있습니다. 또한 유연하고 원인이 눈물 나 다른 명백한 손상 (그림 1B)없이 작은 직경의 튜브에 와서 할 수 있습니다. 장미 접착제는 530과 562 나노 미터에 두 흡수 피크가, 녹색 레이저 ~ 12 μm (그림 3)입니다 따라서 강력하게 532 나노 미터의 접착제 및 해당 감쇠의 길이에 의해 흡수됩니다. 대조적으로, RB없이 키토산 필름 가능성이 높습니다, 약하게 산란에 의한 레이저 (1 / A ~ 162 μm)를 attenuates. 그것은 RB 대한 중요한 집계은 영화에서 발생하지 않는 스펙트럼의 줄거리에서 나타납니다.

은 단단히 접착 채권 장미레이저 조사시 장에 (그림 2) 0.9의 실패의 전형적인 최대 하중 ± 0.4 N (N = 30)을 달성. 접착제 강도는 접착 면적, 즉 15으로 나눈 최대 부하 ± 6 kPa (N = 30)로 추정되었다. 비 방사능 장미 접착제가 조직에 훨씬 적은 보세 (2 ± 2 kPa, N = 30, unpaired t-테스트 P <10 6). 정강 신경의 인 생체 문합이 성공적으로 녹색 레이저와 함께 장미 접착제의 응용 프로그램과 결합에 따라 달성했다. 일주일 postoperatively, 운영 신경이 연속성에 있던 및 수리 강도는 17 살 ± 9 kPa (N = 10).

figure-protocol-1
그림 1. A) RB-키토산 솔루션은 평면 Perspex 판 (슬래브 두께 ~ 5mm)을에 주조되어 있습니다. 그래프 용지는 건조 캐스트 단계를 촉진하기 슬래브 아래에 배치됩니다. 물 불용성 FILM은 2 주 주조 후 얻어진다. B) 장미 접착제는 유연하고 작은 실린더에 압연 할 수 있습니다.

figure-protocol-2
그림 2. 장미 접착제는 레이저 조사 후 종아리 소장에 접착되어 있습니다. 통일 조사는 조직 - 본딩 동안 RB 접착제에 적용되지만 선택 관광은 접착제에 레이저의 사진 표백 효과를 설명하기 위해이 그림에 표시됩니다.

figure-protocol-3
그림 3. 장미 접착제의 흡수 스펙트럼은 (임의의 단위) 530과 562 nm의 두 봉우리를 보여줍니다. 녹색 레이저 (λ = 532 nm 정도)은 따라서 강력 레이저에 노출시 접착제에 의해 흡수됩니다. RB없는 키토산 접착제이 저조한 레이저 빔을 흡수.

N 면적 (mm 2) trong 전원 (W) 시간 (s) Fluence (J / cm 2) I (W / cm 2) 최대로드 / 지역 (kPa)
접착제 + 레이저 30 60 ± 10 0.18 ± 0.03 365 ± 5 ~ 110 ~ 0.9 15 ± 1
점착성의 30 60 ± 10 NA NA NA NA 이 ± 2

표 1. 전설. N, 샘플 번호, 지역, 장미 접착제 (± 최대 오류를 의미)의 면적, 전력, 레이저 전원 (± 최대 오류를 의미), 시간, 조사 시간 (± 최대 오류를 의미), Fluence, 평균 레이저 fluence, I, 예상 irradiance, 최대로드 / 지역, 접착제 면적으로 나눈 값 수리 조직의 실패에서 최대로드 (± SE를 의미).

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토론

이 산성 pH의에서 RB의 해산이 연장 키토산 솔루션의 감동을 필요로하지만 접착제 제조가 간단한 드라이 주조 공정을 기반으로했다. 그것이 물 불용성 필름 될 때까지이 솔루션가 건조하게하는 것이 중요합니다. 체중 물 콘텐츠가 건조 필름 6 ~ 10 % 일 때 발생합니다. 불용성 영화는 일반적으로 온도와 압력 (~ 25 ° C 및 ~ 1 ATM)의 표준 조건에서 이주 드라이 주조 후 얻을 수 있습니다. 이에 레이저를 허용 인접 조직에 접착제에서 RB의 diffuses, 조직 인터페이스에서 효율적를 사진을 활성화하는 관찰되었지만 조직 결합의 메커니즘은 아직 확실하지 않습니다. 이 중항 산소를 생산 RB 능력이 빛을 조사시의 아미노산 그룹 7,8를 통해 crosslinking 조직 콜라겐과 키토산의 역할을 수 있다는 추측 할 수 있습니다. 장미 접착제에 대한 최근의 연구는 최대 온도가 소유하는 동안 달성하는 것도 보여슈 - 접착 접합은 광화학 과정 4의 가설을지지 ~ 32 °...

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이 작품은 UWS 연구 기금에 의해 지원되었다.

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재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
장미 벵골 시그마 - 알드리치 632-69-9
키토산 (중간 MW) 시그마 - 알드리치 10318AJ
빙하 아세트산 시그마 - 알드리치 08050051 2퍼센트 DI 물에 브이 / v
자기 교반기 Heidolph MR 헤이 믹스 S
원심 분리기 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 Allegra X-12R
분광 광도계 Varian 캐리 4000 UV-표시
레이저 CNI 레이저 MGL-532
마이크로 미터 Mitutoyo 시리즈 227
외과 현미경 Zeiss OPMI

참고문헌

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