우리는 DNA glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 분석은 운동 분석 의무의 DNA 복구 활동의 속도를 얻을 조직과 종양의 lysates 또는 정화 단백질과 DNA를 복구 활동의 부량에 대한 적응이다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 기본 절단 수리 (BER) 분자 비콘을 사용하여 DNA를 glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 기판 (비콘)은 6 Carboxyfluorescein (6 식구들) 5'end과 oligonucleotide의 3 '끝까지 복합 Dabcyl 잔기에 복합 잔기와 하나의 기본 병변을 포함 deoxyoligonucleotide 구성되어 있습니다. BER 분자 신호의 길이는 43 기지이며, 순서는 줄기 1,2의 루프와 15 기본 쌍 13 세포핵과 줄기 루프 구조의 형성을 촉진하도록 설계되었습니다. 이 구성에 접혀 때 6 식구들 잔기는 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 3,4 통해 비 형광등 방식으로 Dabcyl에 의해 침묵하고 있습니다. 병변은 6 식구들 잔기를 포함하는 나머지 다섯베이스 oligonucleotide는 줄기에서 발표되는 등 그 다음의 기본 병변 제거 및 스트랜드 절단에 위치하고 있습니다. 풀어DNA 수리의 수준에 비례이다 형광의 증가 끄는 (Dabcyl) 결과에서 차 초연. 복수를 수집하여 형광 값 읽기, BER 활동의 실시간 평가는 가능합니다. 표준 정량 실시간 PCR 악기의 사용은 많은 샘플의 동시 분석이 가능합니다. 이러한 BER 분자 비콘의 디자인은 하나의 기본 병변으로 운동 분석, BER의 부량 및 억제제 검증 의무가 있으며 조직과 종양 세포 lysates의 DNA를 복구 활동의 부량 또는 단백질 정제와 적응이다. 이러한 분자 비콘을 사용하여 종양 lysates이나 조직 aspirates의 BER 활동의 분석은 기능적인 biomarker 측정에 적용할 수 있습니다. 또한, 이러한 양적 분석을 사용하여 단백질을 정제와 BER 활동의 분석 BER 억제제의 발견 및 검증을위한 신속한 높은 처리량 방법을 제공합니다.
프로토콜
1. 분자 표지 디자인
1.1 설계 및 분자 신호를 주문
귀하의 분자 비콘의 디자인은 다음 사항을 고려해야합니다 :
- 우리는 43-메르의의 DNA oligonucleotides와 함께 좋은 결과를 가지고. GC 함량이> 32 %가됩니다. 5 '끝에 G 기지를 제외합니다.
- 요청 6 식구들 (6 Carboxyfluorescein) 5 '끝 그리고 3 등 Dabcyl'수정에 활용.
- 병변의 위치는 5 '끝에서 기지 # 6에 있어야합니다.
- 막대 또는 머리 핀의 자형 이중의 길이가 15 BP 최소이어야합니다.
- 권장 루프 길이는 13 기지입니다.
- 신호기의 전체 구조는 그림 1에 표시됩니다.
- 시퀀스 및 병변 유형이 결정되면, oligonucleotide 가장 Oligonucleotide 기업 주문할 수 있습니다. 우리는 IDT에서 우리 oligonucleotides를 주문하고 oligonucleotides는 HPLC 정화하고 provid 것을 요청분말 또는 말린 형식 에드.
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토론
수많은 분자와 helicase 활동 6의 DNA 중합 효소 활동 7,8, DNA ligase 활동 9, telomerase 활동 10, DNA photolyase 활동 11 DNA를 /을 포함하여 효소 활동을 감지하고 quantifying에 대한 용어는 '분자 비컨'를 사용하여 600 인용 이상있다 많은 사람 중에서 하이브리드 12, RNA. 위에 나열된 DNA의 복구 활동의 측정을위한 분자 비콘의 사용 이외에, 우리와 다른 BER 활동 1,2,13-15의 분석에 대해 이러한 프로브의 유틸리티를 증명하고있다.
우리가 여기에서 설명하는 실시간 BER 활동 분석은 단일 수정된베이스를 통합하고 병변 반대 자료의 다른 병변 또는 변경에 대한 BER 속도의 양적 평가 수 있도록합니다. 응용 프로그램은 분자 기계론의 연구에서 억제제 화면.......
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공개 사항
RWS는 Trevigen 주식 저자의 다른 관심사 아무런 충돌이 없다는 것을 선언에 대한 과학적인 컨설턴트이다.
감사의 글
RWS이 작품은 피츠버그 재단과 국립 연구소 건강 (NIH) [; CA148629 ES019498 GM087798]에서 교부금에 의해 지원되었다. UPCI Lentiviral 시설에 대한 지원은 국립 보건원에서 암 센터 지원 그랜트에 의해 RWS에게 제공한 [P30 CA047904]. 지원은 또한 피츠버그 대학 약리학 계열 및 DS에 대한 화학 생물학에 의해 제공되었다. 지원은 또한 이력서에 ESTRO에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 염화칼륨 | 어부 | P217-500 | 분자 학년 |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 어부 | BP120-500 | |
| 글리세린 | 어부 | BP229-1 | 분자 학년 |
| DTT | 어부 | BP172-5 | |
| HEPES-솔루션 | Invitrogen | 15,630 | |
| HEPES-소금 | 시그마 | H4034-500G | |
| 수산화 칼륨 | 시그마 | 17-8 | |
| 0.22μM 필터 | Nalgene | 167-0020 | |
| 슬라이드-A-Lyzer 투석 제품 | 찌르다 | 66,373 | MW 7000 |
| 주사기 | 어부 | 309,659 | |
| 바늘 | 어부 | 305,196 | |
| 1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브 | 어부 | 05-408-129 | 검정 |
| 15 ML 팔콘 튜브 | 어부 | 352,097 | |
| NucBuster 단백질 추출 키트 | Calbiochem | 71,183 | |
| PBS | Invitrogen | 14,190 | |
| 분자 비콘 | IDT | ||
| BioRad 단백질 분석 염료 재에이전트 농축 | BioRad | 고양이 # 500-0006 |
참고문헌
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor pote....
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재인쇄 및 허가
