태아 마우스 조직에서 신경 능선 - 파생의 연결을 progenitors 정화 최적화된 절차를 설명합니다. 이 방법은 형광 활성화된 셀 정렬 (FACS)에 의해 이산 인구를 분리하기 위해 형광등 기자 대립 유전자로부터 표현의 활용합니다. 기술은 개발 전반에 걸쳐 또는 성인 조직에서 subpopulations의 연결을 분리하여 적용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
개발에 신경 능선 (NC) 중 - 파생의 연결을 progenitors은 소장 및 하부 요로 같은 내장 기관의 자율 신경 구를 형성하는 신경 관에서 떨어져 마이 그 레이션. 레이저 캡처 마이크로 절개와 같은 방법을 사용하여 이산 인구의 분리가 어려운 있도록 개발 중에 성숙한 조직에서이 두 세포는 종종 광범위하게 조직 전체에 분산됩니다. 그들은 그러나 티로신 hydroxylase (TH)와 같은 신경 세포에 특정한 유전자의 규제 영역에서 구동 형광등 기자의 표현에 의해 직접적으로 시각이 될 수 있습니다. 우리는 가능한 TH 높은 수율 + 소장하고 분리와 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS)를 기반으로 더 낮은 urogenital 요로 (LUT)을 포함하여 태아의 마우스를 내장 조직에서 progenitors의 연결을 위해 최적화된 방법을 설명합니다.
번째 유전자는 catecholamines의 생산을위한 속도 - 제한 효소를 인코딩합니다. 장용의 연결을 progenitors는 TH 두어을 표현하기 시작태아 소장 1과 TH들의 이주를 접근한 것은 또한 성인 골반 신경의 뉴런 2-4 집합에 속해 있습니다. 이 혈통 이러한 LUT의 다른 측면에서 뉴런, 그들의 고립 배포의 첫 번째 모습이 설명되지 않았습니다. TH 표현의 연결을 progenitors은 transgene 구조 TG (TH-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1 나르는 생쥐에서 EGFP 표현하여 쉽게 시각이 될 수 있습니다. 우리는 0.5 dpc으로 플러그 검출의 아침을 지정, 15.5 일 게시물 성교 (dpc)에서 개발 LUT에서 TH의 배포판 + 세포를 문서화하는 태아 생쥐에서 transgene 표현 몇 군데, 그리고 관찰 그 coalescing에의 연결을 progenitors의 부분 집합 골반 신경 표현 EGFP.
LUT TH +의 연결을 progenitors를 분리하기 위해, 우리는 초기에 태아의 마우스 소장 2-6에서 신경 능선의 줄기 세포를 정화하는 데 사용된 방법을 최적화. 이정표로 삼았죠 NC-파생 인구를 분리하기 위해 이전의 노력유동세포계측법위한 세포 현탁액을 얻을 수 collagenase와 트립신의 칵테일과 소화. 우리 손에 이러한 방법은 상대적으로 낮은 생존과 LUT에서 세포 현탁액을 생산했다. 태아 LUT 조직에의 연결을 progenitors의 이미 낮은 발병률을 감안할 때, 우리는 최종 dissociates의 세포 생존을 증가된다는 등의 분리 방법을 최적화하기 위해 밖으로 설정합니다. 우리는이 스트림 분석을위한 충분한의 연결을 progenitors의 후속 수율과 함께 지속적으로 더 큰 생존 (총 세포의> 70 %) 달성 허용 낮은 압력에서 정렬을 그 잔잔한 Accumax의 분리 (혁신적인 휴대 기술, INC), 수동 필터링 및 흐름을 결정. 우리가 설명하는 방법은 크게 태아 또는 성인 murine 조직 중 하나의 연결에서 인구의 다양한 분리 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 미디어의 작성 (모든 단계는 조직 문화 후드에서 수행)
- 다음을 결합 : 44 ML의 L-15 중간, 0.5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S), 0.5 ML 100 밀리그램 / ML 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 ML 1M HEPES, 5 ML 조직 문화 학년 워터. 추가하기 전에 철저히 BSA 및 P / S를 섞어주십시오. 이 볼륨은 최대의 분리를위한 다섯 가지 조직 유형에 적합해야합니다. 이 미디어는 조직의 효소 분해 후 사용하기 위해 담금질 솔루션을 준비하는 단계 3.4에 사용됩니다.
- 0.22 μm의 Polyethersulfone (PES) 필터하지만 필터 미디어.
- 1X 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 1X 인산을 준비는 조직 배양 등급 물을 사용하여 10X 주식에서 (PBS) 식염수를 버퍼. 0.22 μm의 PES 필터를 통해 필터링합니다. 이 시약의 대형 볼륨이 미리 준비한 4 ° C에서 저장, 필요에 따라 조직 문화 후드에있는 작은 볼륨을 aliquoting 수 있습니다.
- 1X HBSS, (여러 15 ML 원뿔 튜브를 기입당신이 하위 해부 계획 조직의 숫자) 얼음 튜브를 유지 이만한 튜브의 개수입니다.
2. 해....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
형광 기자를 표출 마우스 기자 라인 murine 유전학 사회 1,8,9의 여러 노력으로 널리 사용되고있다. 따라서 여기에 그림과 분리 방법은 널리 태아 또는 성인 조직 중의 신경 전달 물질이나 수용체 발현 패턴을 바탕으로 이산의 연결을 subtypes의 고립을 위해 적용할 수 있습니다. 우리가 형광등 transgene 기자의 표현을 바탕으로이 방법을 최적화하고 있지만, 그것은 또한 라이브 셀 immuno-라벨링 방법 3-5,10에 의해 표시된 세포 표면 수용체를 표현하는 샘플에 적용할 수 있습니다.
우리 손에서는 분리 절차를 살아남은 세포의 비율에 영향을 여러 가지 요인을 관찰했다. 이들은 태아 조직의 초기 절개에서 유동세포계측법, 필터링시와 흐름 분류기에서 두 세포 현탁액의 부드러운 처리뿐만 아니라 dissoc에 사용되는 효소 유형에 의한 세포의 분리에 대한 경과 시간을 포함iation. 급속한 해부 / 분리 및 세포 정렬 동안 완만한.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 그림과 예술적인 도움 밴더빌트 대학 메디컬 센터와 멜리사 A. Musser에서 유동세포계측법 공유 자원의 지원을 세포 분리 방법과 케빈 Weller, 데이빗 레어 티 및 브르타뉴 맷락요에 대한 제안 캐서린 Alford 감사드립니다. 우리는 Drs 감사드립니다. 의 연결을 progenitors의 절연을 구현에 대한 조언 잭 Mosher와 숀 모리슨. VMC 유동세포계측법 공유 리소스는 밴더빌트 Ingram 암 센터 (P30 CA68485)와 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (P30 DK058404)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 건강 보조금 DK064251, DK086594 및 DK070219의 미국 국립 연구소의 자금 지원에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 이름 | 공급 업체 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| Accumax | 시그마 (mfr : 혁신적인 휴대 기술) | A7089-100ML | 한 ML의 aliquots에 냉동 보관 |
| DNase I | 시그마 | D-4527 | 저장된 -20에서 냉동 ° 1xHBSS의 C 5 밀리그램 / ML, (끄다에서 사용 1시 5분를 끄지) |
| 10X PBS의 산도 7.4 | Gibco | 70011-044 | 그리고 살균 필터는 조직 문화 등급 물로 1X까지 확인 |
| 10X HBSS W / O 칼슘이나 MG | Gibco | 14185-052 | 그리고 살균 필터는 조직 문화 등급 물로 1X까지 확인 |
| Leibovitz의 L-15 배지 | Gibco | 21083027 | |
| 100X 페니실린은 / 스트렙토 마이신 | Gibco | 15140-133 | 저장소가 -20 ° C에서 aliquoted |
| BSA | 시그마 | A3912-100G | -20 ° C, 물 100 밀리그램 / ML에 aliquoted 저장 |
| Biowhittaker 1M은 0.85 % NaCl에 HEPES | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm의 NITEX 나일론 메쉬 막 | Sefar 미국 | 3-38/22 | ~ 3cm의 사각형으로 잘라. 자외선은 조직 문화 후드에서 멸균을 위해 하룻밤 사이에 치료. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 MG / ML |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ML의 폴리스티렌 튜브 | 매 | 352,058 | |
| 15 ML 원뿔 튜브 | 코닝 | 430,790 | |
| 파인 분석 해 봅시다 집게 | 파인 과학 계측기 | 11251-30 | 뒤몽 # 5 Forcep, Dumoxel, 표준 팁 0.1x0.06mm |
| 숟가락을 해부 | 파인 과학 계측기 | 10370-18 |
참고문헌
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospectiv....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.
The authors middle initials were omitted from the publication of An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice.
더 많은 논문 탐색
