외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

요약

이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.

초록

신경 줄기 및 성인 포유류의 뇌 전구 세포 (이하 칭했다 신경 전구체 세포) (NPCs)의 발견은 neuroregenerative 전략의 개발이 세포 multipotent과 proliferative 속성을 활용하기위한 연구의 몸 시켰습니다. 이러한 전략의 성공을위한 중요한 단계는 외인성 이식 후 병변 사이트 향해 나 CNS의 periventricular 지역에서 발견되는 내생 전구체의 반응을 향상시키기 위해 NPCs의 동원이다. 따라서, 그것은, 홍보 안내 및 NPC 마이그레이션을 강화 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다. galvanotaxis로 알려진 현상​​ - 우리의 작품은 홍보 할 수 직류 전기 분야의 활용 (dcEFs)와 직접 NPC 마이그레이션에 초점을 맞추고 있습니다. 내생 생리 전기 분야는 정상적인 개발 및 상처 수리하는 동안 세포 이주에 대한 중요한 단서로 기능을 수행합니다. 의 약리 중단axolotl 배아의 횡단 신경 튜브의 잠재력은 심각한 발달 기형 ^1됩니다. 상처 치유의 맥락에서 상처 각막의 수리 율은 직접 dcEF ^2-3의 약리 향상과 혼란에 도시 된 바와 같이, 부상 후 발생하는 상피 상처 잠재력의 크기와 상관되어 있습니다. 우리는 외부 적용 dcEF에 노출되면 성인 subependymal NPCs는 체외에 신속하고 감독 cathodal 마이그레이션을받을 것을 증명하고있다. 이 프로토콜에서 우리는 높은 해상도, 단일 셀 수준에서 직접 전지 본체의 translocation (마이그레이션)의 장기 관찰을위한 간단하고 효과적인 galvanotaxis 분석을 만들기위한 우리 연구실의 기술을 설명합니다. 이 분석은 유전자 변형이나 한방 마우스, 짧은 간섭 RNA, 또는 특정 수용체​​ agonists / antagonists의 사용을 통해 세포 운동성에 dcEF의 도입을 규제 메커니즘을 조사에 적합한 것입니다.

프로토콜

동물 처리에 관련된 모든 절차는 제도적 지침 (프로토콜 안돼. 20009387)에 따라 토론토 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 다음과 같은 방법은 해당되는 층류 후드에 무균 도구와 기술을 사용하여 수행해야합니다.

아래의 프로토콜 텍스트에서 구문 "EFH-SFM은"표피 성장 인자, 기초 섬유 아세포 성장 인자와 헤파린과 보충 혈청 무료 미디어를 의미합니다. 이 mitogens가 undifferentiated 상태 ⁴ NPCs을 유지하기 때문에 undifferentiated NPCs의 galvanotaxis를 조사 할 때 EFH-SFM이 사용됩니다. 성숙 세포 유형으로 구별하도록 유도 NPCs의 galvanotaxis을 조사 할 때, "FBS-SFM은"1% 태아 소 혈청을 보충 혈청 무료 미디어를 의미합니다. FBS는 성숙한 신경 phenotypes ^5로 NPCs의 차별화를 촉진합니다.

1. 신경 전구체의 분리와 문화 (없음) 비디오에 표시

1. 자궁 경부 전위를 통해 isofluorane과 희생으로 CD1 마우스를 (6~8주 세) 마취시키다.
2. 70 % 에탄올에 머리를 끄게하고 날카로운 해부 가위로 동물을 목을 베다.
3. 수술 집게로 머리를 누른 상태에서 두개골을 노출 등쪽 표면에 피부를 제거합니다.
4. 메스와 더를 사용하지 않습니다. 11 블레이드, mediolateral 축을 따라 정면 굴에서 두개골을 득점하며 rostrocaudal 방향으로 시상 봉합을 따라.
5. 멀리이없는 머리에서 정수리 뼈 껍질. 7 곡선 포셉은 피어스로 뇌 조직을 관리하지 말이지.
6. 소뇌 아래에서 시작하여 후각 구근으로 발전 뇌 아래에 얇은 주걱을 삽입합니다. 포셉과 장소에 두개골을 누른 상태에서 부드럽게 두개골에서 뇌를 당겨 즉시 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수 (아래 레시피를 참조)에 배치합니다.
7. 해부 현미경에서 무균 사용해부 가위와 집게는 중간 선을 따라 반으로 뇌에 상처를 냈어. 중간 (컷) 표면이 이상 직면 수 있도록 각 반구를 회전합니다.
8. 반구를 선택하고 안쪽 표면이 위쪽으로 향해있는 코퍼스의 callosum (코퍼스의 callosum의 뒤쪽 지역)의 splenium를 찾습니다.
9. 피질의 표면에서 dorsoventral 축을 따라 코퍼스 callosum의 splenium에 절개를합니다.
10. 측면 심실의 중간과 측면 벽을 노출 할 수있는 후각 망울을 향해 칼에 베인 피질 껍질을 벗기다.
11. 등쪽 표면이 위쪽으로 직면 있도록 반구를 회전하고, NPCs는 ⁶ 거주 periventricular 지역을 포함하는 노출 안쪽과 측면 벽을 잘라 및 수집 곡선 microscissors을 사용합니다.
12. 반복은 다른 반구에 대한 1.8-1.11 단계를 반복합니다.
13. 15 CC 관 트립신 솔루션 (아래 레시피를 참조) 7 ML로 분리 된 조직을 피펫, 그리고 37 ° C에서 로커에 관을 배치25 분을위한 보육.
14. 5 분에 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기, 표면에 뜨는을 대기음, 그리고 (아래 레시피를 참조) 트립신 억제제 솔루션 2 ML의 조직을 resuspend.
15. 부드럽게 기포를 피하기 위해 조심스럽게 작은 시추공 파스퇴르 피펫 30-50 번과 조직을 씹다.
16. 5 분에 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기, 표면에 뜨는을 대기음, 그리고 펠렛에게 3-5 번 triturating하여 SFM 1-2 ML (아래 레시피를 참조) resuspend.
17. 3 분에 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기, SFM + EFH의의 표면에 뜨는 및 resuspend 1 ML을 대기음.
18. SFM + EFH에 μl 당 10 셀의 밀도에서 T25 문화 플라스크에 혈구와 플레이트 세포와 세포 밀도를 살고 계산합니다.
19. 문화 NPCs 구성 자유 부동 주요 neurospheres를 얻을 수 그대로 7 일 동안 성장 할 수 있습니다.

2. Galvanotaxis 상공 회의소 준​​비

1. 더 세 광장 유리를 놓습니다. 1 커버 용지 (22 X 22 X 0.17 mm) 전하루 아침에 6N 염산이 없음 병.
2. 다음 날, 광장 노에서 유리 6 직사각형 조각을 (22 × 5 X 0.17 mm) 잘라 다이아몬드 팁 유리 커터를 사용합니다. 한 표지 용지.
3. 층류 흐름 후드에 산 세척 광장 전표 및 직사각형 전표를 전송합니다. 조직 문화 수준 autoclaved 물 다음, 70 % 에탄올로 먼저 사각형과 사각형 스트립을 씻고, 그리고 닦아 킴 건조 할 수 있도록 (추가 불임에 대한, 유리는 공기 건조에 허용 될 수 있습니다.)
4. 사각형 유리 슬라이드 중 하나 표면의 경계에 진공 그리스를 적용하고, 60mm 플라스틱 배양 접시의 기본으로 봉인.
5. 직사각형 유리 스트립 중 하나 표면의 긴 축을 따라 진공 그리스를 적용하고, 중앙 트로프를 생성하기 위해 광장 유리 슬라이드의 반대 가장자리 (서로에 평행되도록)로 밀봉.
6. 층류 흐름 후드에 적어도 15 분 동안 방을 UV-소독.
7. 폴리-L-라이시의 피펫 250-300 μl2 시간 동안 실온에서 챔버 및 배양의 중심 트로프로 NE.
8. 부화 기간이 종료하기 전에 약 15 분 (아래 레시피 참조) Matrigel 솔루션을 준비합니다.
9. , 폴리-L-라이신을 기음 autoclaved 물 1 ML, 그리고 중앙 골짜기로 Matrigel 솔루션의 피펫 250-300 μl를 중앙 골짜기을 씻는다.
10. 1 시간에 37 ° C에서 방을 품다.
11. Matrigel 솔루션을 기음 부드럽게 SFM 1-2 ML과 중앙 골짜기을 씻는다.
12. 피펫 100 중앙 골짜기로 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 μl와 계산 현미경의 무대에 galvanotaxis 방을 전송할 수 있습니다.
13. 피펫 3-4 60mm 페트리 접시에 neurosphere 함유 문화의 ML하고 계산 현미경의 무대에 페트리 접시를 전송할 수 있습니다.
14. 5 배의 볼 목적에서, 각 galvanotaxis의 중심 구유에 5-8 전체 neurospheres을 (최대 4 번) 전송 P10 피펫을 사용하여을 dissociating, 그리고 조심스럽게 Matrigel 기판을 중단하지 않고 중앙 구유 주변의 neurospheres을 전파하지 않고 챔버.
15. 중앙 골짜기에 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 추가 150-200 μl를 추가합니다.
16. 37 ° C, 5 % CO _2, 17-20 시간 100 % humidified 인큐베이터에 galvanotaxis 챔버를 전송 (있는 경우 undifferentiated NPCs를 분석) 그림 1과 같이 neurospheres이 Matrigel 기판에 준수 및 단일 세포로 해리 할 수 있도록 . 차별화 된 NPCs를 분석하면, 잠복기는 세포의 분화를 허용하도록 69-72 시간까지 연장해야합니다.

3. 셀 시간 경과 영상 라이브

1. 라이브 셀 이미징 시스템은 37 평형 할 수 있도록 허용 ° C, 5 % 전에 시간 경과 기록의 개시 30 분 최소 CO _2.
2. 한쪽 끝에서 1mm 직경 실버 와이어, 코일 두 12cm의 조각을 잘라, 그리고 Clorox B에 배치여과기는 20 분 동안 자세 / AgCl 전극을 형성한다.
3. 계산 현미경의 무대에 galvanotaxis 챔버를 전송하고 다음 기준에 따라 라이브 셀 이미징 마이그레이션 분석에 사용 될 챔버 선택 전) neurospheres는 세포가 가지고해야합니다) 단일 셀 및 II에 거의 dissociated해야 작은 - 투 - 노 프로세스와 원형 morphologies은 세포 기관에서 확장됩니다.
4. 별도의 정사각형 번호와 함께 층류 후드에 선택한 galvanotaxis 챔버를 전송합니다. 한 유리 커버 슬립 및 진공 그리스.
5. 커버가 autoclaved 물 다음, 70 % 에탄올 처음에 빠져 있으며, 커버 슬립의 두 평행 가장자리에 진공 그리스의 스트립을 적용 씻으십시오.
6. , 챔버의 중앙 구유에서 문화 미디어를 대기음 후 신속하게 두 개의 평행 한 직사각형 유리 스트립에있는 그리스 스트립의 나머지는, 효율적으로 지붕​​을 만들어 있도록 챔버에 커버 슬립 (그리스 측 아래로 향해)를 배치챔버합니다.
7. 모세관 작용을 통해 중앙 구유에 신선한 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 피펫 100 μl.
8. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 중앙 트로프의 각 끝에 문화 미디어 풀을 위해 국경을 만드는 진공 그리스를 사용하십시오.
9. PVC 관의 두 15cm의 조각을 잘라, 그리고주의 깊게 더 거품이 튜브에서 형성되지 보장 튜브에 아가로 오스 솔루션을 주입하는 18 게이지 바늘로 10 CC의 주사기를 사용하고, 젤 5 분 동안 더욱 강화 할 수 있습니다.
10. 아가로 오스 겔 튜브, 자세 / AgCl 전극, 문화 미디어 저수지로 사용됩니다 비어있는 60mm 배양 접시 한 ​​쌍의와 함께 라이브 셀 이미징 시스템에 galvanotaxis 챔버를 전송하고 자세 / AgCl 전극을 포함합니다. galvanotaxis 챔버는 37에서 휴식을 할 수 있도록 허용 ° C, 20-30 분에 대한 5 % CO ₂ 환경입니다.
11. 이 기간 동안 시추 구멍으로 2 빈 배양 접시의 뚜껑과 galvanotaxis 챔버의 페트리 접시의 뚜껑을 준비그 그림 3과 같이 드레 멜 또는 이와 유사한 도구로.
12. 피펫 각 빈 페트리 접시에 중앙 구유의 양쪽 위에 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 1-1.5 ML, 그리고 SFM 7-8 ML. 각 요리에 galvanotaxis 챔버의 중앙 트로프와 놓으 자세 / AgCl 전극의 각면에 놓으 페트리 접시. 그림 4에 도시 된 아가로 오스 겔 다리로 전기 연속성을 확립 할 수있는 galvanotaxis 챔버와 배양 접시 사이에 다리 격차.
13. 전기 전류를 측정 할 수 일련의 전류계로, 외부 전원 공급 장치에 자세 / AgCl 전극을 연결하고 전원 공급 장치를 켜십시오. 직접 중앙 구유에서 전기장의 강도를 측정하는 전압계를 사용하여 원하는 전기장 강도가 (이 실험실에서 수행 assays와 함께 250 뮤직 비디오 / mm의 dcEF 강도를 활용 달성 될 때까지 전원 공급 장치의 출력을 조정 1 1.5 mA 사이의 전류).
14. Initia테는 시간 경과에 라이브 셀 이미징 시스템 모듈 및 실험 시간을 원하는 금액 실행 할 수 있습니다. 분석이 완료되면, 표준 immunostaining 분석을위한 4 % paraformaldehyde에서 셀을 수정합니다.

결과

동 분석은 250 MV / mm dcEF의 존재에 undifferentiated NPCs는 음극 대한 높은 이동 및 빠른 galvanotaxis (그림 5A, 영화 1) 전시 것을 보여줍니다. dcEF의 부재에서 세포의 무작위 운동 (그림 5B, 영화 2) 관찰된다. 이 필드 강도에서 undifferentiated NPCs의> 98 %가 그들이 이미징하는 동안 전체 6-8 시간에 대한 마이그레이션, 죽은 세포가 마이그레이션되지 않기 때문에이 사람들이 dcEF의 부재 또는 존재하는이 기간 동안 가능한 상태로 유지하는 것이 좋습니다.

차별화 된 phenotypes는 존재와 dcEF의 부재 (영화 3, 4)에 모두 무시할 마이그레이션을 받고있다. 차별화 된 세포의 일부는 dcEF의 방향에 수직 정렬하는 경향이 프로세스를 확장 있지만, 눈에 띄는 전지 본체의 translocation을 준...

토론

이 프로토콜은 이전 연구 ^7-9의 잘 알려진 방법에서 적응되었습니다. Galvanotactic 챔버는 세포 시딩의 구속, 또는 중앙 트로프 ^10,11의 microfabrication에 대한 CO ₂ 레이저 절제를 사용하는 잘 별도의 유리의 건설 등 다양한 기법, 다양한을 사용하여 구성 할 수 있습니다. 일부 기술은 다른 것보다 더 힘든거나 비용이 많이 드는 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 대부분의 세포 생물학 실험실에있는 재료를 사용하여 NPC galvanotaxis 챔버를 만들기위한 간단하고 비용 효율적인 분석을 설명하고 있습니다. 우리 프로토콜은 지속적으로 장기 이미징을위한 최적의 조건에서 세포를 유지하는 라이브 세포 이미징 시스템을 둘러싸는 온수, humidified, CO ₂ 규제 보육이 포함되어 있습니다. 이러한 장치의 부족은 일부 이전에 다음 ID로 출판 기술 ^9,12의 제한 사항입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항목의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
			신경 전구체 세포 절연
2M NaCl	시그마	S5886	11.688 g 100 ML DH 2 O에 용해
1M KCl	시그마	P5405	7.456 g 100 ML DH 2 O에 용해
100 MgCl 2	시그마	M2393	20.33 g 100 ML DH 2 O에 용해
155 MM NaHCO 3	시그마	S5761	1.302 g 100 ML DH 2 O에 용해
0.5M 포도당	시그마	G6152	9.01 g 100에 용해ML DH 2 O
108 MM CaCl 2	시그마	C7902	1.59 g 100 ML DH 2 O에 용해
페니실린 - 스트렙토 마이신	Gibco	15,070
소 췌장의 트립신	시그마	T1005
양 hyaluronidase 고환	시그마	H6254
Kynurenic 산	시그마	K3375
Ovomucoid 트립신 억제제	워싱턴	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30 % 포도당	시그마	G6152
7.5 % NaHCO 3	시그마	S5761
100 HEPES	시그마	H3375	23.83 g 100 ML DH 2 O에 용해
L-글루타민	Gibco	25,030
EGF	Invitrogen	PMG8041	20 μl 단위로 호르몬 믹스와 나누어지는 1 ML에 Reconstitute.
FGF	Invitrogen	PHG0226	20 μl 단위로 호르몬 믹스와 나누어지는의 0.5 ML의 Reconstitute.
헤파린	시그마	H3149
APO-트랜스페린	R & D 시스템	3188-AT	0.1 g 4 ML DH 2 0에 녹
Putrescine	시그마	P7505	APO-트랜스페린에 9.61 밀리그램을 수 있도록 분해lution
인슐린	시그마	I5500	0.1N HCL의 0.5 ML에 25 밀리그램를 해산하고 DH 2 0 3.5 ML에 추가
셀렌	시그마	S9133
Progesterone	시그마	P6149
표준 해부 도구	정밀 과학 도구
해부 현미경	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis 상공 회의소 준비
광장 유리 커버 슬라이드	VWR	16,004
6N 염산	VWR	BDH3204-1
높은 진공 그리스	다우 코닝
60mm 페트리 요리	피셔 과학	0875713A
폴리-L-라이신	시그마	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	150 μl 단위로 해동과 나누어지는
FBS	Invitrogen	10082139	NPC의 차별화를 유도 경우에만 사용, 그렇지 않으면 SFM 사용 + EFH 문화 미디어는 위에 표시
현미경을 계산	하늘	CKX41
			셀 시간 경과 영상 라이브
실버 와이어	알파 Aesar	11,434
UltraPure 아가로 오스	Invitrogen	15510-027
열 Inactivated FBS	시그마	16140071
PVC 관	피셔 과학	80000006	32분의 3 "ID X 32분의 5"OD
표백	Clorox
10 CC 주사기	BD	309604
18 게이지 바늘	BD	305195
드레 멜 드릴	드레 멜	모델 750
역 현미경 humidified, incubated 챔버가 장착	Zeiss	Axiovert-200M
			요리법 항목 음량 2M NaCl 6.2 ML 1M KCl 0.5 ML 100 MgCl 2 0.32 ML 155mM NaHCO 3 16.9 ML 1M 포도당 한 ML 108 MM CaCl 2 0.09256 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 한 ML Autoclaved 물 74 ML 인공 뇌척수 항목 볼륨 또는 질량 인공 뇌척수 30 ML 소 췌장의 트립신 40 MG 양 hyaluronidase 고환 22.8 MG Kynurenic 산 5 MG 트립신 솔루션 항목 볼륨 또는 질량 SFM 15 ML Ovomucoid 트립신 억제제 10 MG 트립신 억제제 솔루션 항목 음량 Autoclaved 물 37 ML 10X DMEM/F12 10 ML 30 % 포도당 2 ML 7.5 % NaHCO 3 1.5 ML 100 HEPES 0.5 ML 트랜스페린, Putrescine 솔루션 4 ML 25 MG의 인슐린 솔루션 4 ML 셀렌 100 & 무; 리터 Progesterone 100 μl 호르몬 믹스 (-20 ° C 100 ML 총, 상점) 항목 음량 Autoclaved 물 37.5 ML 10X DMEM/F12 (3시 1분) 5 ML 30 % 포도당 한 ML 7.5 % NaHCO 3 0.75 ML 100 HEPES 0.25 ML 호르몬 믹스 5 ML L-글루타민 0.5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 0.5 ML 혈청 무료 미디어 EFH-SFM은 : EGF의 10 μl, FGF 10 μl, 그리고 헤파린 FBS-SFM의 3.66 μl를 추가합니다 : 0.5 ML FBS를 추가
항목	음량
Matrigel	150 μl
SFM	3.6 ML

항목	볼륨 또는 질량
UltraPure 아가로 오스	10 ML ddH 2 0 300 MG
SFM 열 Inactivated FBS	8 ML 2 ML