단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

Summary

우리는 단일 분자 형광 이미징을위한 최소화 유체 역학적 크기 콜로이드 양자 점의 준비에 대해 설명합니다. 기존의 양자 점에 비해,이 나노 입자는 구형 단백질의 크기와 비슷합니다 및 단일 분자 밝기, photodegradation에 대한 안정성 및 단백질과 세포에 특이 현상 바인딩에 대한 저항에 최적화되어 있습니다.

Abstract

단일 분자 이미징은 biomolecular 기능의 메커니즘을 이해하고 세포 생물학 ^1-4 기초 분자 행동의 공간과 시간적 이질성을 시각화를위한 중요한 도구입니다. 이미지의 관심 개별 분자를로, 일반적으로 형광 태그 (염료, 단백질, 구슬, 또는 양자 점)에 복합 및 epifluorescence 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경으로 관찰합니다. 염료와 형광 단백질 수십 년 동안 형광 이미징의 의지가되는 것되었습니다 있지만, 자신의 형광 신호의 전체 손실되기 전에 관찰 몇 초 만에 항복, 개별 분자를 관찰 할 필요가 높은 광자 fluxes에서 불안정합니다. 라텍스 구슬 및 염료 표시된 구슬은 개선 신호 안정성을 제공하지만, deleteriously 연구 아래에있는 분자의 확산과 동작을 변경할 수 있습니다 획기적으로 큰 유체 역학적 크기의 비용. ntent는 "> 양자 점 (QDs)은이 두 문제가 정권 사이의 균형을 제공합니다.이 나노 입자는 반도체 재료로 구성되어 있으며 photodegradation ⁵ 뛰어난 저항과 hydrodynamically 소형 크기 설계 할 수 있습니다. 따라서 최근 몇 년 동안 QDs 사용 설정에 역할을되었습니다 단일 분자 수준에서 복잡한 macromolecular 문제의 장기 관찰. 그러나 이러한 입자는 여전히 이러한 자신의 크기가 여전히 ^4,6 너무 큰 세포 세포질과 분열 neuronal 신경 등 사람들이 많은 분자 환경에서 장애 확산을 전시 할 수 발견되었습니다 ^{, 7.}

콜로이드 안정성, photostability, 밝기, 그리고 과거 ^8,9에 소형 QDs의 유틸리티를 방해 한 특이 현상 바인딩 오프셋을 균형하면서 최근 우리는 코어와 최소화 유체 역학적 크기 QDs의 표면 코팅을 설계했습니다. 이 문서의 목적은 입증하는 것입니다절연 카드뮴 _Y 아연 _{1 Y} S 쉘, 짧은 폴리에틸렌 글리콜과 수정 multidentate 고분자 리간드들과의 코팅 (코팅 합금 HG _X CD _1-X 놈들이 코어 구성이 최적화 된 nanocrystals의 합성, 수정, 및 특성, PEG) 체인 (그림 1). 기존의 CdSe의 nanocrystals에 비해, HG _X CD _1-X 놈들이 합금은 강화 된 세포의 신호 대 노이즈 비 세포 독성 눈에 보이는 파장의 여기에 붉은 색과 가까운 적외선 파장에서 형광, 형광의 큰 양자 수율을 제공합니다. Multidentate 폴리머 코팅 유체 역학적 크기를 최소화하기 위해 폐쇄와 평면 형태의 nanocrystal의 표면에 바인딩, 그리고 PEG는 세포와 분자에 특이 현상 바인딩을 최소화하기 위해 표면 전하를 중화. 최종 결과는 550-800 nm의 12 나노 미터 근처에있는 총 유체 역학적 크기 사이의 방출과 밝은 형광 nanocrystal입니다. 이들에많은 수용성 구형 세포의 단백질, 그리고 기존의 PEGylated QDs (25-35 nm 정도)보다 실질적으로 더 작은으로 보자 크기까지 다양합니다.

Protocol

다음 합성 절차는 표준 공기 무료 기술과 진공 / 불활성 가스 매니 폴드의 사용을 포함, 자세한 방법론은 참조 10 호와 11 호에서 찾을 수 있습니다. 모든 잠재적 인 독성 및 가연성 물질에 대한 MSDS는 사용하기 전에 조언을해야하고 모든 가연성 및 / 또는 공기 불안정한 화합물은 글러브 박스 나 장갑 가방에 심장 - 밀봉 된 병에 aliquoted해야합니다.

1. 머큐리 카드뮴 셀렌의 합성 (HG _X CD _1-X SE) 양자 도트 코어

1. trioctylphosphine (TOP)에서 셀레늄의 0.4 M 솔루션을 준비합니다. 50 ML 3 목 플라스크에 셀레늄 (0.316 g, 4 mmol)을 추가 한 다음 벗어나 아르곤은 Schlenk 라인을 사용하여 입력합니다. 공기가없는 상황에서 (건조 질소 또는 아르곤 분위기), 100-10 ML의 TOP와 열을 추가 ° C 명확한, 무색의 솔루션을 창출하고 1 시간에 감동하면서. 실내 온도에 솔루션을 시원하고 옆 술병을 설정합니다.
2. 250 ML 3 목 플라스크에, 카드뮴 산화물을 추가 (CDO 0.0770 g, 0.6 mmol), tetradecylphosphonic 산 (TDPA, 0.3674 g, 1.32 mmol)....

Results

그림 2는 CdSe nanocrystals, 양이온 교환 후 HG _X CD _1-X 놈들의 nanocrystals, 그리고 HG _X CD _1-X 놈들이 / CD _Y 아연 쉘 성장 후 _1-Y S nanocrystals을위한 대표 흡수 및 형광 스펙트럼을 도시한다. 핵심 CdSe의 nanocrystals는 양자 15% 근처에 형광 수율 (긴 파장 깊은 트랩 방출 포함)하지만 효율성이 표면 원자 방해 ^구를 통해 소개 캐리어 트랩을 청구 할 가능성이 때문에 수은이 교환 한 후 1 % 미만으로 떨어되어 있습니다. 그러나 카드뮴 아연 _{Y 1 Y} S의 얇은 껍질의 성장은 주로 물 (50 % 전형적인)로 전송 한 후 유지 70 % 이상,이 효율성을 향상. 두꺼운 껍질이 성장하지 않는 반면, 수은 설립없이 CdSe / CD _Y 아연

Discussion

기존의 CdSe 양자 점에 비해, 삼원 합금 HG _X CD _1-X 놈들의 nanocrystals는 크기와 독립적으로 형광 파장에서 조정 할 수 있습니다. 크기가 처음 CdSe nanocrystal 코어의 합성 중에 선택되어 있으며, 형광 파장은 실질적으로 nanocrystal 크기 ⁹ 변경하지 않는 보조 수은 양이온 교환 단계에서 선택됩니다. 그것은 정화 HG _X CD _1-X 놈들의 nanocrystals이 상한 전에 최소 24 시간 동안 실온에서 배양 할 수 있도록하는 것이 중요합니다. 이 약하게 adsorbed 수은 양이온의 일부가 nanocrystal 격자로 확산 할 수 있습니다. 이 과정은 가까운 적외선에서 두 번째 형광 밴드 발생 할 수없이 자주 dissociated 수은 이온의 HgS nanocrystals의 균일 한 핵으로 인해 관찰된다.

이 작품에 표시된 예제에서,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
셀렌	시그마 - 알드리치	229865
트라이-N-octylphosphine	Strem	15-6655	97%, 순수한 공기 불안정
산화 카드뮴	시그마 - 알드리치	202894	높은 독성 : 사용주의
Tetradecylphosphonic 산	PCI 합성	4671-75-4
Octadecene	알파 Aesar	L11004	기술 등급
Hexadecylamine	시그마 - 알드리치	H7408
Diphenylphosphine	시그마 - 알드리치	252964
수은 아세테이트	시그마 - 알드리치	456012	높은 독성 : 사용주의
1 Octanethiol	시그마 - 알드리치	471836	강한 냄새
올레산	시그마 - 알드리치	W281506
아연 아세테이트	알파 Aesar	35,792
아세테이트 하이드레이트를 카드뮴	시그마 - 알드리치	229490	높은 독성 : 사용주의
Oleylamine	피셔 과학	AC12954	공기 불안정
황	시그마 - 알드리치	344621
Trioctylphosphine 산화	Strem	15-6661	99%
피리딘	VWR	EM-PX2012-6	무수의
Thioglycerol	시그마 - 알드리치	M1753	강한 냄새
Triethylamine	시그마 - 알드리치	471283	무수의
투석 관	스펙트럼 연구소	131342	20 kDa의 차단
원심 필터	Millipore	UFC801024	10 kDa의 차단
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 다
DMTMM, 4 - (4,6-Dimethoxy-1 ,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium 염화물 수화물	알파 Aesar	H26333
AKTAprime 플러스 크로마토 그래피 시스템	GE 헬스 케어
Superose 6 300분의 10 GL 크로마토 그래피 칼럼	GE 헬스 케어	17-5172-01
아가로 오스, OmniPur	VWR	EM-2120
			충수 수은 octanethiolate의 합성 : 천천히 1 octanethiol (. 3 EQ)와 실온에서 메탄올의 수산화 칼륨 (. 3 EQ)의 감동 솔루션에 수은 아세테이트 (1. EQ)의 메탄올 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 여과를 통해 수은 (II) octanethiolate의 침전물을 분리, 에테르와 메탄올 한 번으로 두 번 씻어하고, 진공 후 건조합니다. multidentate 폴리머의 합성 : 30 분에 아르곤과 150 ML 세 목이 술병과 거품의 25 ML의 dimethylformamide (DMF)에 polyacrylic 산 (1 G, 1773 다) 디졸브. 10 ML의 DMF의 cysteamine (374 MG, 4.87 mmol)의 무수 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 활발한 저어가있는 방 온도에서 천천히 무수 diisopropylcarbodiimide을 추가 (DIC, 30 triethylamine (170 μl, 1.22 mmol) 다음 분, 그리고 반응이 60에서 72 시간 동안 진행 할 수 있습니다 ° C. 이상 736 MG, 5.83 mmol) 반응을 해소하고, 실온에서 2 시간에 휘몰아 치기 (501 MG, 6.41 mmol) 메르 캅토 에탄올을 추가합니다. 회전 증발을 통해 DMF를 제거하고 얼음처럼 차가운 아세톤의 2시 1분 혼합물의 추가와 고분자 분리 : 클로로포름, 원심 분리 한 다음 있습니다. 디 에틸 에테르, 그리고 반복으로 다시 ~ 5 ML 무수 DMF, 필터에 고분자를 침전 분해. 아르곤에 따라 진공 및 매장에 따라 제품을 말린다. CdSe 코어 직경의 결정 : UV-VIS 흡수 스펙트럼에서의 긴 파장 피크 (예를 들면 그림 2A의 CdSe에 약 498 nm 정도)입니다 처음 exciton 피크 (λ, NM에서)의 파장을 결정하고,를 사용하여 Mulvaney와 동료 (12)의 곡선 크기 조정 : CdSe nanocrystal 농도의 결정 : CdSe nanocrystals의 광학 명확한 솔루션의 배경 - 공제 UV-VIS 스펙트럼에서, 350 nm의 파장에서 흡수를 결정한다. 시리얼 dilutions는 광 흡수가 맥주의 법칙의 선형 범위 내에 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. nanocrystal 농도 (QD, M의가)에서 다음과 같은 방정식으로 nanocrystal 직경 (D, NM에서), 광학 흡수 값 (A 3sa) 및 큐벳 경로 길이 (L, cm에서)에 연결해에 의해 결정될 수있다 Bawendi와 동료 (13)의 경험적 상관 관계 :