절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

Summary

제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.

Abstract

확장 성 심근증 (DCM)은 젊은 성인 ¹ 심장 마비의 주요 원인 중 하나입니다. 독성 물질에 대한 유전 처분 및 박람회가 환자의 약 셋째에서이 질병에 대한 원인을 알려져 있지만, DCM의 출처는 대부분 불분명 남아 있습니다. 이 환자의 상당수에서 심장 epitopes에 대한 autoantibodies가 감지되었으며 질병 ^2,3의 발병과 진행에 중요한 역할을 의심하고 있습니다. 심장 autoantibodies의 중요성은 immunoadsorption ^3-5로 autoantibodies의 제거 후 DCM 환자에서 관찰 hemodynamic 개선에서 빨간 밑줄이 있습니다. 특정 항원의 다양한 이미 ^2,3를 확인하고 있으며 이러한 목표에 대한 항체가 immunoassays에 의해 검출 될 수있다. 그러나, 이러한 assays은 자극 (및 따라서 기능적 효과)와 autoantibodies을 차단 구별 할 수 없습니다. eviden 명이 증가이 구별이 중요한 ^6,7입니다 CE. 또한 cardiotropic 항체의 수에 대한 목표는 여전히 미확인이며, 따라서 immunoassays에 의해 감지 할 수 있다고 가정 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 각각의 항원과는 독립적 기능 활성화 cardiotropic 항체의 검출하는 방법을 설립했습니다. 방법의 배경은 일반적으로 포유 동물 ^8,9 사이에 심장 단백질의 기능 영역에 대한 관찰 높은 호몰 로지입니다. 이 인간의 항원에 대한 감독이 심장 항체 성인 쥐 cardiomyocytes에 DCM 환자에서 IgG의 테스트를 할 수 있습니다 이외의 인간 대상 세포와 함께 상호 반응 제안한다. 우리의 방법은 3 단계로 구성 : 첫 번째는 IgG는 immunoadsorption 열 (PlasmaSelect, Teterow, 독일)에서 얻은 세 파로스 결합 항 IgG 항체를 사용하는 환자의 혈장에서 분리됩니다. 둘째, 성인 cardiomyocytes는 AP를 사용하여 Langendorff 재관류 장치에 collagenase 재관류에 의해 고립되어rotocol은 이전 작품에서 ^10,11을 수정했습니다. 획득 cardiomyocytes는 laminin 코팅 쏠의 coverglasses에 부착 Fura-2, 쉽게 (CA ^{2 +)} 내용 ¹² 세포 내 칼슘을 관찰하는 셀에 반입 할 수있는 칼슘 선택성 형광 염료를 물들입니다. 마지막 단계에서, 세포 단축 및 CA ² 환자 IgG의 효과 ⁺ 필드에 자극을 cardiomyocytes의 과도는 표준 역 형광등에 연결된 상업 myocyte 칼슘, 수축성 모니터링 시스템 (IonOptix, 밀튼, MA, USA)를 사용하여 온라인으로 감시하고 있습니다 현미경.

Protocol

1. 환자 샘플에서 IgG 절연

1. 빈 Econo 팩 칼럼으로 두 ML 환자의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 플라즈마 당 3 ML 항 IgG 세 파로스를 작성하여 미니 immunoadsorption 항목을 준비합니다. IgG 격리는 환자 플라즈마의 최소한 2 ML이 필요합니다.
2. 반 IgG 세 파로스 상단에 필터를 넣고, 열 아래 팁을 열고 잘라 약 1 방울 / 초의 유량에 도달 할 필터를 누르십시오. 열이 부족 보존 솔루션을 보자.
3. 3 권 플라즈마의 볼륨 당 NaCl 0.9 %로 열을 씻으십시오.
4. 열에서 플라즈마를 피펫. 플라즈마 완전히 반 IgG 세 파로스에 몰두했을 때, 같은 볼륨 0.9 % NaCl로 씻는다.
5. 피펫 한 플라즈마 열에서 0.2 M 글리신 HCL, pH를 2.8의 볼륨과 세 파로스로 잠그다 보자. 열에 글리신 HCL의 또 다른 볼륨을 추가합니다. 15 ML 관을 통해 흐름을 수집하여 0.5 M 트리스 - HCL, pH를 8.0로 7.3으로 산도를 조정합니다.
6. 열을 생성하려면3 플라즈마 볼륨 글리신 HCL을 씻는다. 2 권 0.9 % NaCl로 최종 세척 후, 열은 다음 플라즈마 샘플에 사용할 수 있습니다. ° C 최대 4 주까지 8 - 또는 열이 보존 솔루션으로 가득과 4에 저장할 수 있습니다.
7. cardiomyocytes에서 사용하기 위해, 수집 된 IgG 분획은 실험 버퍼 (EB)에 대해 dialyzed해야합니다. EB의 준비를 들어, 117 MM NaCl, 2.8 MM KCl, 0.6 MM MgCl _2, 1.2 MM KH ₂ PO _4, 1.2 MM CaCl _2, 10 밀리미터 HEPES 및 자기 교반기에 20 밀리미터 포도당 1 L 증류수로 추가하고 pH를 조정 7.3 있습니다.
8. 100 kDa의 차단 분자량과 셀룰로오스 에스테르 투석 막 관에 IgG의 일부를 입력합니다. 1 L의 EB에 튜브를 넣고, 4에서 자기 교반기로 천천히 저어 ° C. 8 시간 후, 신선한 EB 3 L로 투석 튜브를 전송하고 4시에 또 다른 20 시간을위한 dialyze ° C.
9. inactivat 할 수있는 물 욕조에 57시 30 분 ° C에 대한 투석, 열에게 샘플을 따라전자 보완 요소. 총 IgG 농도를 결정 및 330 μg IgG 각을 포함하는 aliquots를 준비합니다. 측정 (단계 4.3)에 대한 cardiomyocytes에 샘플을 추가 할 때, EB 1 ML에 aliquots를 입력합니다. Undiluted aliquots는 더 이상 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. 쥐 Cardiomyocytes의 절연

1. 칼슘 ^{2 +} 무료 절연 버퍼 (IB)의 준비를 들어, 110 MM NaCl, 2.6 MM KCl, 1.2 MM MgSO _4, 1.2 MM KH ₂ PO _4, 20 밀리미터 HEPES과 자기를 사용하여 1 L 증류수 11 으 포도당을 추가 교반기. 살균을위한 0.2 μm 병 톱 필터를 통해 실내 온도 및 필터에서 7.4로 산도를 조정합니다.
2. thermostated Langendorff 재관류 시스템의 상부 저수지에서 IB의 80 ML을 입력합니다. 37 ° C의 버퍼 온도를 유지하고 95% O _{5분의 2} % 30 분에 CO _2와 버퍼를 폭기하는 온도 설정을 조정합니다.
3. 약 10,000 무게 - collag의 12,000 U를enase 유형 II, 175 MG 지방산 무료 BSA하고 100 MM CaCl ₂ 재고 솔루션의 22.5 μl를 포함하는 20 ML IB에 용해. 상단 저장소의 절연 버퍼의 pH를 제어하고 필요한 경우 조정합니다.
4. 375 μg / kg 체중의 thiopental 200 G - 175의 Wistar 쥐를 마취시키다. thiopental 솔루션에 2,500 IU의 헤파린을 추가합니다. 그대로 대동맥 활과주의 깊게 thoracotomy, 소비세 마음에와 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl로 전송. 혈액의 마음과 주변 조직과 신선한 0.9 % NaCl로 전송를 청소합니다. 대동맥을 노출, 2-3/sec의 하락 속도를 얻고 캐뉼라에 마음을 첨부 Langendorff 시스템의 흐름 감속기를 엽니 다.
5. 까지 남은 피를 씻어 한 방울 / 초의 유량과 3 분에 대한 마음을 Perfuse. Langendorff 시스템의 IB를 순환하기 시작한다. 상부 저수지부터 20 ML 버퍼를 제거 등의 80 ML에 도달하는 데 필요한 많은 버퍼로 collagenase 솔루션과 리필 입력합니다. C를 순환 또 다른 27 분에 ollagenase 솔루션입니다. 유량은 흐름 감속기를 사용하여 한 방울 / 초에서 정기적으로 관리 및 유지 관리해야합니다.
6. 심방과 대동맥에서 깨끗한 캐뉼라의 마음을, 이탈 작은 조각으로 썰어. collagenase 솔루션은 낮은 저수지로 실행하도록 허용, 40 ML의 최대 볼륨을 줄이고 더 10 다진 심실을 소화 % - 95 % O가 _{5분의 2} %의 CO ₂ 연속 폭기에서 15 분. 그 후 50 ML 튜브에 200 μm의 메쉬 크기 거즈를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
7. 200 μM에게 CaCl _2를 포함하는 10 ML의 IB의 객실 온도와 resuspend 세포에서 2 분에 43 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기 : 3 단계에서 세포의 칼슘 ^{2 +} 내용을 복원합니다. 다시 원심 분리기, 500 μM CaCl ₂ 10 ML IB에서 셀을 resuspend. 최종 원심 분리 50,000 세포 / ML의 밀도에 살균 필터 EB의 cardiomyocytes을 (1.8 참조) resuspend 후.

Cardiomyocytes의 "> 3 e_title. Fura-2 염색법

1. 코트 10 μg의 당 잘 laminin과 완전히 건조 될 때까지 기다리과 4 잘 쏠 수 coverglass.
2. 각이 잘 커팅 팁과 micropipette를 사용하여에 cardiomyocyte 정지 1 ML을 입력합니다. 세포가 실온에서 1 시간에 준수 할 수 있습니다.
3. 10 일 MG / ML의 μl Fura-2 5 ML의 EB의 주식 솔루션입니다.를 희석 어둠 속에서 착색 솔루션세요.
4. coverglass 각도에 착색 솔루션의 피펫 0.5 ML의 버퍼와 무소속의 세포를 벗어. 적당한 흔들림에 따라 10 분에 세포를 배양. 그 후, 착색 솔루션을 벗고 일 ML의 EB를 한 번 세포를 씻어 마지막으로 각도에 0.5 ML의 EB를 채 웁니다. 착색 과정에서 직접 빛을 방지하고 항상 어둠 속에서 스테인드 세포를 유지.

4. 셀 단축 및 CA ^{2 +} 과도의 기록

1. 역 형광의 m에 쏠의 coverglass를 삽입icroscope는 myocyte 칼슘, 수축성 기록 시스템에 연결되어 있습니다. 물론 처음에 유입 및 유출 관과 맞춤 제작 전극을 배치합니다. 1 ML / 분 EB와 (20 V, 1 Hz에서, 5 밀리 초 시간) 전기 자극을 시작으로 Superfuse cardiomyocytes. 세포가 약 2 분의 자극에 적응 할 수 있도록 허용합니다.
2. 분명 결 지속적인 수축과 손상로드 모양의 cardiomyocyte를 선택합니다. 시야의 중심에있는 셀을 위치와 카메라 채널을 엽니 다. 셀 프레임 어댑터를 회전하고 현미경 단계를 이동하여 비디오 영역에서 수평으로 셀을 일정한 방향으로 향하게.
3. 초기 셀 단축 및 CA ^{2 +} 과도를 얻기 위해 15 수축 - 가장자리가 동영상 영역의 제어 요소 (그림 2)을 검출 조정, 형광 채널과 기록이 10여십시오.
4. 형광 얼룩의 표백 방지하기 위해 현미경 광 채널을 닫습니다. 샘플로 EB에서을 통해 흐름을 전환환자 IgG 1 ML과 3 방향 밸브 및 superfuse의 cardiomyocytes으로 우회. 공기가 잘 도달 전에 펌프를 중지합니다.
5. 빛 채널을 열고 또 다른 10 기록 - 급성 세포 응답을 얻기 위해 15 수축합니다. 녹화를 일시 중지하고 다시 조명 채널을 닫습니다. 이 후 녹음 및 5 분 반복합니다.
6. 우물의 전극을보십시오. EB와 철저하게 튜브를 청소하고 쏠 수의 coverglass의 다음 잘를 계속합니다.
7. 각각 세포 단축 및 CA ^{2 +} 'Edge-Length/Length "를 사용하여 IonWizard 소프트웨어와 과도하고"fura 2 숫자는 / 비율을 뺀'창을 분석합니다. 초기 셀 단축 및 CA ^{2 +} 급성의 기준 (BL %에서 최대 H)에 언급 된 피크 높이의 과도, 2 분, 5 분 응답에서 변경 률을 계산합니다.

Results

분야에서 세포 inotropy의 측정을위한 두 예제는 아래에 myocyte 칼슘 ^{2 +} 및 수축성 기록 시스템을 사용하여 성인 cardiomyocytes을 (그림 2) 자극. 그림 3은 제어 측정의 인상을줍니다, 그림 4에있는 동안 cardiodepressive 항체의 효과 있는 환자의 DCM가 표시됩니다.

에서 두 예, 초기 세포 단축 및 CA ^{2 +} EB있는 superfusion 동안 과도은 분석을위한 전제 조건입니다, 명확하고 지속적인 봉우리을 나타냅니다. 우리의 응용 프로그램에 대한 최선의 14 % 정장, 낮거나 높은 초기 수축성과 cardiomyocytes은 종종 세포 단축의 부당한 변경 사항을 전시하는 경향이있는 동안 - 우리는 7 범위에서 초기 파 % 최대 H를 전시 세포가 있다는 경험 알아요. 제어 IgG의 신청 후 즉,

Discussion

제시 방법은 불분명 출신 DCM 환자에서 기능적으로 효과적인 심장 autoantibodies를 감지 할 수있는 적절한 방법을 제공합니다. 다른 방법에 비해, 캠프 레벨 ^6에 미치는 영향에 의해 β1-adrenoceptor에 대한 기능을 활성화 항체의 검출을 예를 들어, 우리의 방법은 특정 에피토프의 독립적입니다. 물론 문학에 설명 된 다른 에피토프 독립 assays는 IE 패치 클램프 기술 또는 절연 Purkinje 섬유 ^(14)의 수축성에 의해 성인 cardiomyocytes의 칼슘 전류를 측정하는 신생아 cardiomyocytes ^13의 박동 속도를 계산, 있습니다. 이러한 방법으로 활용에서, 여기에 제시된 분석에는 시간이 많이 걸릴 적을 수 있으며 표준화 된 프로토콜에 따라 증가 객관성을 제공합니다. 또한, 동시에 수축성과 세포 내 칼슘 과도에 미치는 영향을 감지 할 수 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 장비의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
Immunosorba 보존 솔루션	Fresenius 의료	903609211
Collagenase 2 형	셀 시스템	LS004176
BSA, 지방산 무료	시그마 - 알드리치	A6003
Laminin	시그마 - 알드리치	L2020
Fura-2 AM	시그마 - 알드리치	F0888	DMSO 1 MG / ML
Econo 팩 크로마토 그래피 열	BioRad	732-1010
스펙트럼 / 포 바이오 셀룰로오스 에스터 투석 Membran전자	Spectrumlabs	131417
네 잘 쏠 수 Coverglass	Nunc	155383
Myocyte 칼슘과 수축성 기록 시스템	IonOptix
IonWizard 6.0 분석 소프트웨어	IonOptix