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두 번 스트랜드 바꿈이 (DSBs) 가장 해로운 DNA 아르 것은 셀 발생할 수 있습니다 병변. unrepaired 왼쪽 경우, DSBs 항구 잠재력은 돌연변이와 염색체 aberrations 하나를 생성합니다. DSBs을 감지하는 세포가 DNA 손상 반응 (DDR)을 활성화하고, DNA를 수리에 대한 게놈 불안정성을 catalyzing에서이 외상을 방지하기 위해, 그것은 매우 중요합니다. 자극하면, DDR 수리가 이루어 또는 apoptosis를 받아야하는 셀을 강제 할 수 있도록 세포주기의 체포를 실행하여 게놈 무결성을 유지하기 위해 노력하고 있습니다. DSB 수리의 주된 메커니즘은 nonhomologous 최종 입사 (NHEJ) 및 동종 재조합 수리 (HRR) (2에서 검토)를 통해 발생합니다. 그의 활동을 정확하게 DDR가 제대로 작동 할 수 있도록 조정해야합니다 많은 단백질이 있습니다. 이러한 단백질 중 하나 53BP1의 3 차원 (D) 시각화 - 여기, 우리는 2에 대한 방법을 설명합니다.
p53의 결합 단백질 1 (53BP1는)의 영역에 localizes5-15분 5에서 foci를 형성, 수정 histones 3,4에 바인딩하여 DSBs. DSB 사이트에 53BP1 및 기타 DDR 단백질의 히스톤 수정 및 채용은 피해 지역 주변 염색질의 구조 다시 정리하기를 촉진하고 DNA 복구 6 기여할 것으로되어 있습니다. 수리에 직접 참여 외에도 추가 역할은 이러한 내부-S 검사 점 (Checkpoint), G2 / M 검문소를 조절하고 하류 DDR 단백질에게 7-9 활성화로 DDR에 53BP1에 대해 설명되어 있습니다. 최근,이 53BP1 대신 DSBs 6 근처에 로컬 라이즈하기 전에 G1를 입력 할 셀을 기다리고, 유사 분열 동안 유도 DNA 손상에 대한 응답으로 foci를 형성하지 않는 것을 발견했습니다. 같은 53BP1 등의 DDR 단백질은 세포의 유사 분열부터 10까지 진행하는 동안 mitotic 구조 (예 : kinetochores 등)과 연관이 발견되었습니다.
이 프로토콜에서 우리는 (2)의 사용을 설명 - 3-D 라이브 세포 이미징은 시각화하는DNA 손상 대리인 camptothecin (CPT)뿐만 아니라, 유사 분열 동안 53BP1의 행동에 대응 53BP1 foci의 형성. Camptothecin는 주로 DNA 복제 동안 DSBs의 원인이 제가 억제제가 topoisomerase입니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 이전에 설명 53BP1 - mCherry 형광 융합 단백질은 DSBs 11 바인딩 할 수 53BP1 단백질 도메인으로 구성을 구성했습니다. 또한, 우리는 히스톤 H2B-GFP 형광 융합 단백질은 세포의 유사 분열 12시 세포주기에 걸쳐 있지만, 특히 염색질 역학을 모니터링 할 수 구성 사용됩니다. 여러 차원에서 라이브 셀 이미징은 진핵 세포의 DDR 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 깊게 할 수있는 훌륭한 도구입니다.