Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Marko Popovic; Xin Gao; Dejan Zecevic

doi:10.3791/4261

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방법 논문

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

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DOI:

10.3791/4261

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2012년 11월 29일

Marko Popovic¹ , Xin Gao¹ , Dejan Zecevic¹

¹Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

이 논문에서

요약

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

초록

biophysical 속성과 하나의 뉴런의 기능 조직을 이해하고 어떻게 프로세스 정보가 뇌가 어떻게 작동하는지 이해하는 중요한 요소입니다. 모든 신경 세포의 주요 기능은 보통 여러 소스에서 전기 신호를 처리하는 것입니다. neuronal 프로세스의 전기적 특성은 세부 측정의 부재에 예측하기 매우 복잡한 동적, 그리고 일반 경우에는 불가능합니다. 하나가 겠어 이러한 측정을 얻으려면 이상적으로, 그들은 neuronal 프로세스 및 작업 가능성 개시에 영향을 특정 위치에서 summate에 원산지 사이트의 여행으로 여러 사이트에서 subthreshold 이벤트를 모니터링 할 수 싶어요. 이 목표는 전극을 채용 측정의 기술적 한계로 인해 모든 신경을 달성되지 않았습니다. 이 단점을 극복하기 위해, 그것은 광범위한 병렬 recordin을 허용 이미징 기술을 패치 - 전극 접근 방식을 보완하기 위해 매우 바람직하다신경 세포의 모든 부분에서 GS. 하위 밀리 초와 하위 마이크로 미터 해상도의 특징 - 유기 전압에 민감한 염료 (V _m-영상)과 막 잠재적 인 과도의 광학 녹음 - 여기, 우리는 이러한 기술을 설명합니다. 우리의 방법은 전압에 민감한 분자 프로브 ² 선구적인 작업을 기반으로합니다. 초기 기술의 여러 측면이 지속적으로 수십 년 ^{3, 5, 11을} 통해 향상되었습니다. 또한, 이전의 작품은 V _{m 이미징의} 두 중요한 특성을 문서화. 첫째, 형광 신호는 전체 생리적 범위 (, ^{10, 14, 16} 100 뮤직 비디오에 -100 뮤직 비디오)를 통해 막전위에 비례합니다. 둘째, 여기에 사용되는 전압에 민감한 염료 (JPW 3028)와로드 뉴런이 감지 약리 효과가 없습니다. 기록 염료를로드하는 동안 스파이크를 확대하는 ^{것은 7 4} 완전히 치료입니다. 또한, 실험 증거는 확보하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다모든 감지 phototoxic 효과 ⁴ 이전 녹음의 상당수 (최대 ^{수백), 6, 12, 13.} 현재, 우리는 V _m-이미징 기술의 감도를 극대화 할에 가까운 최적의 파장 레이저 광원의 뛰어난 밝기와 안정성의 이점을 누리십시오. 현재 감도는 axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 가지, 개인 수지상의 쪽 포함하여 신경 세포의 모든 부분에서 V _m의 과도의 여러 사이트 광학 녹음 할 수 있습니다. 신호의 상호 작용을 취득 정보뿐만 아니라 동영상의 형태로 직접 시각화와 같은 양적 분석 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 장비 설치

1.1 단계. 영상 설정

전압에 민감한 염료 신호를 기록하기위한 핵심은 적절한 설치 디자인입니다. 우리는 세 대의 카메라가 장착 수직 현미경 (BX51WI 올림푸스 또는 Zeiss AxioExaminer)을 사용합니다. 설정은 니콘 60X/1.0 NA 또는 Zeiss 63X/1.0 NA 물을 찍어 목표를 사용하여 에피 형광, 넓은 필드 현미경 모드에서 여기 빛으로 뇌 조각의 조명 개별 뉴런을 위해 설계되었습니다. 우리 현미경은 진동 절연 테이블에 고정 방문객 이동 단계가 구비되어 있습니다. 각 현미경은 세 카메라 포트를 갖추고 있습니다. 하나의 카메라 포트는 비디오 현미경 (IR-1000, Dage MTI, USA) 적외선 DIC에 대한 표준 높은 공간 해상도 CCD 카메라가 있습니다. 두 번째 카메라 포트는 상대적으로 낮은 공간 해상도 (80 X 80 픽셀)하지만, 뛰어난 동적 범위 (14 비트) 및 읽기 매우 낮은과 빠른 데이터 수집 카메라 (최대 20 kHz에서 프레임 속도)이소음 (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, 디카 터, GA). 에 대한 공 촛점 이미지의 Z-스택을 수집하는 데 사용하는 회전 - 디스크 공 촛점 스캐너 (CSU-10, 요코, ....