전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

요약

설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

초록

설계 근육 조직은 재생 의료 및 육류 대체 ^1로 압력 궤양을 공부하는 예를 체외에서 질병 모델로 사용하기위한 조직의 생산을 포함하는 여러 가지 목적으로 사용 할 수 있습니다. 첫 번째보고 3D 근육 구조는 몇 년 전에 만든 분야의 개척자 Vandenburgh 및 동료 ^2,3 아르되었습니다. 근육 조직 공학에서 만든 발전 생화학 요인, 줄기 세포 및 전구 세포에 대한 지식의 광대 한 이득의 결과뿐만 아니라하지만, 물리적 요인이 세포 행동 제어에 필수적인 역할을하는 연구자들에 의해 얻은 통찰력의 특정 기반에 있고 조직 개발. 첨단 엔지니어링 근육은 현재 셀 인구 히드로 겔 구조로 구성되어 구성합니다. 우리가 실험실에서이 일반적으로 C2C12, 미 손쥐 뒷다리 근육에서 분리 손쥐 myoblast의 전구 세포, 또는 손쥐 myoblast 세포 라인으로 구성콜라겐 / Matrigel의 혼합물로 xed 두 개의 고정 지점 사이의 도금, 근육 인대를 모방. 다른 세포는,뿐 아니라 L6 쥐 myoblasts ^4, 신생아 근육 유래 전구 세포 ^5, 그러한 인간의 ^6도 유도 만능 줄기 세포 (IPS 세포) ^7과 같은 다른 종에서 성인 근육 조직에서 파생 된 세포와 같은 예를 들어 다른 세포 라인을 고려 될 수있다 . 셀 수축성은 구조 ^8,9와 문화 약 1 주일 후에 근육 전구 세포의 분화의 긴 축을 따라 세포의 정렬을 발생합니다. 또한, 전기 자극의 응용 프로그램이 어느 정도 ^8로 차별화 과정을 향상시킬 수 있습니다. 때문에 그 제한된 크기 (8 X 2 X 0.5 mm)의 전체 조직은 예 생존, 분화 및 세포 정렬을 모니터링 할 공 촛점 현미경을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 특정 응용 프로그램에 enginee에 대한 요구 사항을 따라붉은 근육 조직은 경우에 따라 다릅니다, 다른 종에 고기 대체 번역이 필요한 역할을하는 동안 재생 의료에 대한 예를 들어 사용, 조직 크기와 vascularization의 최대 크기 조절이 필요합니다.

프로토콜

1. 손쥐 Myoblast의 전구 세포 또는 C2C12 세포의 문화

1. 처음 Shefer 및 동료 ^(10)에 의해 출판하고 나중에 콜린스 외. ¹¹ Boonen 외. ¹² 적응 프로토콜에 따라 세포를 분리 및 액체 질소에 이것들을 저장합니다. 이 마우스, 예를 들어 C57Bl / 6이 필요합니다. 다른 방법은 예를 들어 리 Y 외하여 시각화 실험의 저널에 출판하는 방법, 다른 실험실에 사용됩니다. ^13. 시약 및 장비를 들어 당신은 7 페이지와 8의 표라고합니다. 하나의 마우스에서 근육에서 일반적으로 액체 질소의 약 20 병을 cryopreserve하기에 충분한 세포를 얻을 수 있습니다. 다음, 우리는 액체 질소 저장에서 세포를 해동 할 수있는 프로토콜을 시작합니다.
2. 25cm ² Matrigel (1 MG / ML) 코팅 조직 배양 플라스크에 한 유리 병에서 세포를 놓고 이루어진 성장 매체 (GM) (335 ML DMEM 고급, 100 ML 태아 bovin을 추가전자 혈청 (FBS), 50 ML HS, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML L-glutam....

결과

최종 제품은 그림 3에 표시된 근육 구조 될 것입니다. 조직의 크기는 길이 약 8mm, 폭 2mm와 두께 0.5 mm 될 것입니다. 차별화 동안 전기 자극은 마이 오신 중쇄 isoforms의 표현을 변경되지만, 차별화 매체 (8)에 의해 유도로 크게 차별화 프로세스를 개선하지 않지만, 전기 자극은 근육의 기능을 확인하기 위해 절차의 끝 부분에 적용 할 수 왜냐하면 완전히 개발 sarcomeres와 근육이 전기 펄스에 계약을 체결 할 수있을 것입니다.

차별화와 성숙은 조직 또는 전체 마운트 스테인드 조직 샘플로 만든 두 섹션에 근육 성숙 마커 또는 교차 결 개발 (알파 actinin에 대한 예 착색)에 대한 유전자 발현 평가 및 착색에 대한 정량적 PCR을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 근육 성숙과 차별화를 침착 하테드 유전자와 마이 오신 중쇄 표현이 예 MyoD, myogenin, MFR4 및 MLP, 그리고 M.......

토론

근육 조직의 공학 재생 의학의 약물 검사에 대한 질병 모델 등과 고기 생산을위한 사용하기위한 잠재력이 있습니다. 그러나 이러한 응용 프로그램에 대한 요구 사항은 다양합니다. 콜라겐은 세포 정렬이 가능하기 때문에 이전의 2D 연구 ¹² 결정 myoblast의 전구 세포는 지하 막 파생 된 단백질의 존재를 필요로하기 때문에 우리는 콜라겐과 matrigel의 조합과 협력하기로 결정했습니다. 또한, 섬유소의 젤은 우리의 실험실에서 테스트하고 콜라겐과 Matrigel ™의 혼합물이 수행 특히 조직 압축 ¹⁴ 연결되지 않는 C2C12 myoblast 및 전구 세포를 지원하지 듯되었습니다. 셀 라인 ^15를 사용하는 동안 여기에 설명 된대로 모델은 압력 궤양 손상에 대한 연구에서 이미 사용되었습니다. 재생 의료 어플리케이션의 경우, 인간의 위성 세포의 번역은 최근 ^{6,16 만든되었습니다.} 또한,고기 소비 대체 소스로 기술은 잠재력이 ^{하나 있습니다.}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
Matrigel - 성장 인자가 감소	Beckton 및 디킨슨
DMEM (높은 혈당) *	Gibco	42,430
고급 DMEM	Gibco	12,491
말 혈청	Gibco	65050-122
태아 소 혈청	Greiner	758075
0.45와 0.22 μm 주사기 필터 *	Whatmann (Schleicher와 Scheull)	10462100
L-글루타민	Gibco	25030024
페니실린 / 스트렙토 마이신	Gibco	10378016
Amphotericin	Gibco	15290-018
문화 플라스틱	Greiner		문화 플라스크와 피펫을 포함
칙의 배아 추출물	미국 생물	C3999
파스퇴르 피펫 *	Hilgenberg		면, 오픈 팁 L과 수축이있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫, : 0,9의 팁 직경 230mm - 1,1 mm
파스퇴르 피펫 *	Hilgenberg		면, 오픈 팁 L과 수축이있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫, : 1,4의 팁 직경 230mm - 1,6 mm
파스퇴르 피펫	VWR	612-1702
Collagenase 유형 I*	시그마	C0130-16
40 μm 셀 스트레이너 *	BD 팔콘	352340
19G 바늘
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