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방법 논문

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

11.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/4350

⸱

2012년 9월 28일

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

이 논문에서

요약

본 연구에서는 살아있는 제브라피시 배아 내에서 광전환형 형광 단백질(PCFPs)의 광활성화 스위칭 방법과, 발달 과정 중 특정 시점에서 광전환된 단백질을 추적하는 방법을 제시합니다. 이 방법론을 통해 살아있는 척추동물 유기체 내에서 다양한 발달 과정의 근간이 되는 세포 생물학적 사건들을 모니터링할 수 있습니다.

초록

배아 발생은 in vivo에서 발달 변화를 기록할 수 있는 기술을 통해 가장 잘 연구될 수 있는 역동적인 과정입니다. 유전적으로 부호화된 형광 단백질의 사용은 온전한 유기체 내에서 일어나는 역동적인 형태 형성 과정을 규명하는 데 가치 있는 전략임이 입증되었습니다. 지난 10년 동안 광활성화 및 광전환 가능 형광 단백질의 개발은 표지된 단백질의 특정 하위 집단의 운명을 조사할 수 있는 가능성을 열어주었습니다1. 광활성화 단백질과 달리, 광전환 가능 형광 단백질(PCFPs)은 광전환 전의 고유 방출 상태에서 쉽게 추적 및 이미징이 가능하므로, 광학적 검사를 통해 영역을 식별하고 선택하는 것이 더 용이합니다. Kaede2, KikGR3, Dendra4 및 EosFP5와 같은 PCFPs는 His-Tyr-Gly 트리펩타이드 서열 덕분에 UV 또는 청색광에 노출되면 녹색에서 적색으로 전환될 수 있으며, 이 서열은 빛으로 촉매되는 β-제거 반응과 그에 따른 π-공액 체계의 확장을 통해 적색으로 광전환될 수 있는 녹색 발색단을 형성합니다3. PCFPs와 그 단량체 변이체들은 각각 세포 추적6-10 및 단백질 역학 연구11-14에 유용한 도구입니다. 최근 몇 년 동안 세포 운명 추적을 위해 제브라피시6, 닭7,8, 생쥐9,10와 같은 다양한 동물 모델에서 PCFPs가 발현되었습니다. 본 논문에서는 살아있는 제브라피시 배아에서 PCFPs의 세포 특이적 광전환 및 이후 발달 단계에서 광전환된 단백질을 추가로 추적하는 프로토콜을 보고합니다. 이 방법론을 통해 제브라피시 동물 모델에서 형태 형성의 기초가 되는 세포 생물학적 사건들을 조직 특이적인 방식으로 연구할 수 있습니다.

프로토콜

1. 광전환 분석을 위한 배아 확보

PCFP를 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 교배시킨 후, 가장 밝게 빛나는 동형접합 배아를 선택하여 원하는 배아 단계15까지 28.5 °C에서 배양합니다.

참고 1: 이러한 사전 선택을 통해 낮은 레이저 출력으로 배아를 스캔할 수 있으며, 이를 통해 광독성 및 광퇴색을 방지할 수 있습니다.

참고 2: Kaede 및 KikGR과 같은 PCFP는 일광을 포함한 빛 노출에 매우 민감하므로, 배아를 시각화할 때는 저강도 조명을 사용하고 암조건에서 유지할 것을 권장합니다.

2. 포매딩

  1. 난수(egg-water)가 담긴 유리 용기에서 실체현미경으로 관찰하며 핀셋을 사용하여 배아의 난막을 제거한다.
  2. 난막이 제거된 배아를 0.16 mg/ml Tricaine (3-amino benzoic acidethylester, Sigma-Aldrich) 용액(E3 medium 1X 1 ml에 4 mg/ml 스톡 용액 40μl 혼합)으로 옮겨 배아를 마취시킨다.

참고 1: 배아의 손상 위험을 최소화하기 위해 유리 피펫 또는 팁 끝을 자른 (P1000) 피펫을 사용하여 배아를 옮기십시오.

참고 2: 어린 탈난막 배아는 기계적 스트레스에 의해 알이 쉽게 파열될 수 있으므로, 공기에 노출시키거나 수면/공기 경계면까지 들어 올려서는 안 됩니다.

  1. 마취된 배아를 배양 접시의 덮개 위로 옮기고, 가능한 최소한의 배지 부피 내에서 배아를 유지합니다.
  2. 0.16 mg/ml Tricaine이 포함된 30 °C의 1% 저융점 아가로스(LMA, Lonza)로 배아를 피펫팅하여 아가로스로 옮긴 후, 커버글라스 바닥 배양 접시(MatTek Corp. Ashland MA USA)의 커버글라스 위에 놓습니다. 이어서 매끄러운 플라스틱 팁(예: 절단된 Microloader Pipette Tip, Eppendorf)을 사용하여 배아의 방향을 잡고, LMA가 중합되면 0.16 mg/ml Tricaine 용액으로 아가로스를 덮습니다.

참고 1: 1% LMA를 60 °C에서 녹인 후, 녹은 아가로스를 30 °C로 유지하십시오.

3. 광전환

  1. Zeiss LSM 710과 같이 405 nm, 488 nm 및 561 nm 레이저 광원이 장착된 도립 공초점 현미경에서, 향후 광전환 및 추적 대상이 될 표본의 전체 구조를 포괄하는 z-Stack 스캔을 통해 샘플을 시각화한다. 이때 488 nm 레이저(i.e., 30 mW Ar 레이저, 강도 5-7%, 검출기 설정 493-540 nm)와 561 nm 레이저(i.e., 10 mW DPSS 561 레이저, 강도 7-9%, 검출기 설정 587-651)를 사용하여 조직/기관 내 광전환 단백질의 녹색 및 적색 형광을 각각 스캔한다.

참고 1: 광전환 전 스캔에는 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 대물렌즈를 사용하였습니다.

참고 2: 실험 전에 항상 적색 형광을 스캔하여, 실수로 생성된 적색 전환 PCFP가 존재하지 않는지 확인하십시오.

  1. Time series 도구를 선택하고 간격 없이 2회 사이클로 설정합니다(광전환 전과 후 각각 1회씩).
  2. Regions 도구를 선택하고 광전환을 위한 하나 이상의 관심 영역(ROI)을 정의합니다.

참고 1: 세포나 단백질의 이동이 예상되지 않는 고정 시료에서 세 방향(xy 및 z 방향) 모두의 광전환된 조직/세포 영역을 측정함으로써, ROI 내에서 스캐닝 레이저에 의해 실제로 광전환된 영역이 소프트웨어에서 선택한 ROI와 일치하는 정밀도를 먼저 결정할 것을 권장합니다. 본 애플리케이션에 기술된 설정의 경우, ROI는 광전환된 영역과 매우 정밀하게 일치했으나, 이는 사용된 대물렌즈 및 광전환에 적용된 레이저 양에 따라 달라집니다. ROI의 크기는 대물렌즈의 개구수, 줌 배율 및 광전환에 사용된 레이저 광량에 따라 단일 세포 크기까지 줄일 수 있습니다.

  1. Bleaching 도구를 선택하고 2회 중 1번째 스캔 후에 표백이 시작되도록 설정합니다. 광전환을 위해 30 mW 405 nm 다이오드 레이저를 사용하였으며, 레이저 광의 강도, ROI의 스캔 반복 횟수 및 픽셀 시간(i.e., 스캔 속도)을 조절하여 완전한 광전환에 필요한 최소한의 레이저 광량을 세심하게 최적화하였습니다.

참고 1: 광전환(photoconversion)을 위해 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 대물렌즈를 사용하였습니다.

참고 2: 레이저 출력과 반복 횟수는 각 실험 설정에 따라 경험적으로 결정해야 하며, 광독성을 줄이기 위해 필요한 최소한의 레이저 광량으로 ROI 내에서 green에서 red PCFP로의 완전한 광전환이 이루어지도록 해야 합니다. 낮은 레이저 출력(예: 3%, 대물렌즈 평면에서 0.03 mW에 해당)과 적은 반복 횟수(예: 20회)로 테스트를 시작한 후, 완전한 광전환이 달성될 때까지 레이저 출력을 점진적으로 높이는 것을 권장하며, 본 실험팀의 경우 레이저 출력 10%(대물렌즈 평면에서 0.1 mW에 해당)에서 광전환이 완료되었습니다. 이러한 조건 하에서 테스트한 모든 배아는 처리 계획 후 생존하였습니다. 그럼에도 불구하고, 난황막은 레이저 펄스에 민감하여 쉽게 손상될 수 있으며, 이는 배아의 사망으로 이어질 수 있음을 확인하였습니다. 이러한 이유로, 표적 조직의 위치가 난황체와 가까울 경우 광전환 후 배아 치사율이 높아질 수 있습니다.

  1. 488 nm 및 561 nm 레이저를 사용하여 샘플을 z-Stack으로 스캔함으로써, 잔류하는 녹색 형광과 광전환된 PCFP의 적색 형광을 시각화합니다.

참고 1: 광전환 후 스캔에는 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 렌즈를 사용하였습니다.

4. 아가로스에서 배아 제거하기

  1. 용액을 버리고 바늘이나 매끄러운 플라스틱 팁을 사용하여 1% LMA에서 배아를 조심스럽게 꺼냅니다.
  2. 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배아를 28.5 °C의 암조건 egg water에서 유지합니다.

참고 1: 배아가 특히 배아 체구가 확장되는 발달 초기 며칠 동안 난수(egg water)에서 계속 발달하는 것이 중요합니다. 실제로 일부 배아 조직/기관은 발달 과정에서 위치가 변하므로, 관심 있는 특정 조직/기관 및 분석하고자 하는 발달 단계에 따라 포매 시 특정 방향 설정이 필요합니다.

5. 재포매

  1. 본 프로토콜의 2.) 항목에 따라 진행하십시오.

6. 후기 배아 단계에서 광전환된 조직 추적하기

  1. 녹색 및 적색 형광 신호를 위해 각각 488 nm 및 561 nm 레이저를 사용하여 관심 영역을 스캔(z-Stack)합니다.

참고 1: 광전환 후 x시간 시점의 스캔을 위해 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 렌즈를 사용하였습니다.

참고 2: 본 프로토콜은 배아의 정상적인 발달에 영향을 주지 않으므로, 발달 후기 단계에서 광전환된 배아를 관찰하는 것이 가능합니다(이를 위해 4 - 6번 항목에 설명된 절차를 따르십시오).

7. 대표 결과

광전환 분석(photoconversion assay)의 예가 Figure 1에 나와 있습니다. 연구진은 제브라피시 발달 과정 동안 혈관 내피세포를 추적하였습니다(발달 중인 제브라피시의 혈관 해부학에 대한 리뷰는 16을 참조하십시오). 이에 따라 혈관 내피 핵 내에서 KikGR을 발현하는 제브라피시 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 리포터 라인을 사용하였습니다17. 호모자이고트이며 강하게 발현하는 배아를 수정 후 48시간(hpf)까지 28.5 °C에서 배양하였습니다. 난막을 제거한 후, 배아를 마취시키고 LMA에 매립하여 머리 혈관을 더 잘 관찰할 수 있도록 배아의 전-배측이 커버 글라스를 향하게 배치하였습니다. 광전환 분석 및 광전환된 단백질의 추가 추적을 위해 405 nm, 488 nm, 561 nm에서 작동하는 레이저와 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 대물렌즈가 장착된 도립 공초점 현미경(Zeiss LSM 710 Meta)을 사용하였습니다. Figure 1A에서 보는 바와 같이, 광전환 전의 KikGR은 혈관 내피 조직 내에서 발현되었으며 488 nm Argon 레이저를 사용했을 때만 녹색 형광으로 검출되었습니다. 적색 형광 확인을 위해 561 nm DPSS 561-10 레이저로 컨트롤 스캔을 수행한 결과, 광전환 전에는 광전환된 KikGR이 검출되지 않았습니다(Figure 1A). 이후 405 nm Diode 레이저(강도 10%, 20회 반복)를 사용하여 ROI를 완전히 광전환시켰으며, 488 nm 및 561 nm 레이저를 사용하여 머리 혈관을 다시 스캔하였습니다(Figure 1B). Figure 1B에 나타난 것처럼, ROI 내에서 녹색 KikGR이 적색으로 완전히 전환되었습니다. 광전환 분석 후, 배아를 아가로스에서 꺼내어 난수(egg water) 내 28.5 °C에서 배양하였습니다. 마지막으로, 후기 단계에서 광전환된 혈관 내피세포를 추적하기 위해 광전환 24시간 후(약 72 hpf)에 배아를 다시 관찰하였습니다(Figure 1C). 이를 위해 배아를 LMA에 매립하고 488 nm 및 561 nm 레이저를 사용하여 샘플을 재스캔하였습니다. Figure 1C에서 볼 수 있듯이, 광전환된 ROI에서 기원한 혈관 내피 조직 내에서 적색 형광으로 광전환된 KikGR의 안정성과 새로운 녹색 비광전환 KikGR의 재합성으로 인해 비광전환 및 광전환 KikGR 단백질이 모두 관찰되었습니다.

제브라피시의 광전환 과정; 시간에 따른 현미경 이미지 내 형광 단백질의 변화.
그림 1. 제브라피시 발달 과정 중 KikGR의 광전환. (A,B) Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 형질전환 배아의 48 hpf 시점에서 두부 내피 혈관의 특정 영역을 광전환하였고, (C) 광전환 24시간 후(약 72 hpf)에 다시 관찰하였다. KikGR의 형광(녹색), 광전환된 KikGR(적색) 및 병합 채널을 나타낸 것이다. 점선 원은 광전환 전, 후, 그리고 광전환 24시간 후의 ROI를 보여준다. 이미지는 제브라피시 배아의 배면도이며, 아래쪽이 전방이다. 스케일 바: 50 μm.

단백질 (약어)Ex (nm)Em (nm)EC QY4차 구조밝기 응용 분야참고문헌
Kaede_G508518990.9tetramer259세포 추적2,6
Kaede_R572580600.3tetramer59
KikGR_G507517540.7tetramer112세포 추적3,6,8-10
KikGR_R583593350.6tetramer68
mKikGR_G505515490.7monomer101동적 추적 초고해상도 이미지13
mKikGR_R580591280.6monomer53
EosFP_G506516720.7tetramer150세포 추적5,20
EosFP_R571581410.5tetramer67
tdEos_G506516340.7tandem dimer165초고해상도 이미지12,14,21
tdEos_R569581330.6tandem dimer59
mEos2_G506519560.7monomer140동적 추적 초고해상도 이미지11,18
mEos2_R573584460.7monomer90
Dendra2_G490507450.5monomer67동적 추적 초고해상도 이미지4,11
Dendra2_R553573350.55monomer57

표 I. 광전환 가능 형광 단백질의 특성. 각 PCFP의 일반 명칭 및/또는 약어와 함께, 최대 들뜸(Ex) 및 방출(Em) 파장, 몰 흡광 계수(EC, 10-3 M-1 cm-1 ), 양자 수율(QY), 생리학적 관련 4차 구조, 상대적 밝기(EGFP 대비 %), 응용 분야 및 참고 문헌이 표에 제시되어 있습니다. Day와 Davidson, 20101의 표를 수정하여 인용함.

PCFP제브라피시 형질전환 라인출처
KaedeTg(elavl3:Kaede)rw0130aOkamoto Lab
Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) 
Tg(ins:Kaede) 
Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) 
Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ZIRC
Tg(myl7:kaede) 
Tg(olig2:Kaede) 
Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999tZIRC
Tg(UAS:Kaede)rk8ZIRC
Tg(vsx2:Kaede)nns2Higashijima Lab
KikGRTg(kdrl:nlsKikGR) 
Tg(krt4:NTR-KikGR) 
Tg(myl7:nlsKikGR) 
Tg(sox10:KikGR) 
Tg(UAS:KikGR) 
EosFPTg(sox10:EosFP) 
Tg(sox10:nlsEosFP) 
DendraTg(-8mpx:Dendra2) 
Tg(UAS:Dendra-kras) 

표 II. PCFP를 발현하는 제브라피쉬 형질전환 라인. 제브라피쉬 모델 생물 데이터베이스(ZFIN, http://zfin.org/)에서 얻은 데이터이다. 제브라피쉬 국제 자원 센터(ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/)에서의 라인 제공 가능 여부가 표시되어 있다.

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토론

최근 몇 년 동안 Kaede 또는 KikGR과 같은 광전환 단백질(photoconvertible proteins)의 발현을 위한 형질전환 동물 모델들이 제작되었습니다. 이러한 동물들은 정상적으로 발달하며, 이는 해당 단백질들이 배아 발달에 독성 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 동물 배아 내 세포 추적을 위한 광전환 분석(photoconversion assay)에 관한 첫 보고는 Hatta 연구팀에 의해 수행되었으며, 이들은 범용적 발현을 위해 Kaede를 코딩하는 mRNA 또는 DNA를 제브라피시 1세포 배아에 주입하거나, Gal4-UAS 시스템을 사용하여 신경 조직에서 Kaede와 KikGR을 발현시켰습니다6. 이들은 세포의 이동과 신경 형태의 추적을 시각화할 수 있었으며, 이는 신경관 형성, placode 형성 및 후뇌의 초기 교차 축삭(commissural axons) 경로 탐색과 같은 형태 형성 과정을 추적하는 이 도구의 다재다능함을 입증했습니다6. 닭 모델에서는 전기천공법(ele...

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공개 사항

선언된 이해상충 없음.

감사의 글

캐나다 토론토의 Hospital for Sick Children에서 제브라피시 형질전환 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 라인을 친절히 제공해주신 Ian C. Scott 박사님께 감사드립니다. 또한 훌륭한 기술 지원과 전반적인 이미징 지원을 해주신 Confocal and 2-Photon Microscopy Core Facility (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine)와 Zoltan Cseresnyes 박사님께 감사드립니다. S.A.-S.는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)의 Heisenberg 펠로우십 지원을 받습니다. 본 연구는 DFG grant SE2016/7-1의 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
재료:
물고기 사육 및 알 수집에 필요한 장비 (자세한 내용은 Zebrafish Book22 참조).
실체 현미경LeicaLecia MZ6 Stereomicroscope488 nm에서 작동하는 레이저 장착
공초점 레이저 주사 현미경ZeissZeiss LSM 710 NLO488 nm, 561 nm 및 405 nm에서 작동하는 레이저 장착
히팅 블록
Dumont #5 핀셋 한 쌍
커버글라스 바닥 배양 접시MatTek CorpAshland MA USA
마이크로로더 피펫 팁Eppendorf
볼텍스 믹서
바늘
시약:
난수 배지
ddH2O 내 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts
E3 배지
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO4
0.00001% (w/v) Methylene Blue
4 mg/ml Tricaine 스톡 용액
400 mg Tricaine (3-amino benzoic acid ethylester)Sigma-Aldrich
97.9 ml ddH2O
2.1 ml 1M Tris (pH9)
pH 7로 조정 후 분주하여 -20 °C에 보관
1% LMA (저융점 아가로스, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 medium 1X
분주하여 4 °C에 보관

참고문헌

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  21. Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
  22. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).

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