방법 논문

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

DOI:

10.3791/4350

⸱

2012년 9월 28일

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 살아있는 제브라피시 배아에서 광전환성 형광 단백질(PCFP)의 광활성화 전환과 발달 중 특정 시점에서 광변환 단백질을 추적하는 방법을 제시합니다. 이 방법론을 사용하면 살아있는 척추동물 유기체의 다양한 발달 과정의 기저에 있는 세포의 생물학적 사건을 모니터링할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

배발생은 생체 내에서 발달 변화를 문서화할 수 있는 기술을 사용하여 가장 잘 연구되는 동적 과정입니다. 유전적으로 암호화된 형광 단백질의 사용은 온전한 유기체에서 발생하는 역동적인 형태 유전 과정을 설명하기 위한 귀중한 전략임이 입증되었습니다. 지난 10년 동안 광활성성 및 광전환성 형광 단백질의 개발로 태그가 지정된 단백질1의 개별 하위 집단의 운명을 조사할 수 있는 가능성이 열렸습니다. 광활성성 단백질과 달리 광변환성 형광 단백질(PCFP)은 광변환 전에 기본 방출 상태에서 쉽게 추적하고 이미지화할 수 있으므로 광학 검사로 영역을 쉽게 식별하고 선택할 수 있습니다. Kaede2, KikGR3, Dendra4 및 EosFP5와 같은 PCFP는 광 촉매 β 제거 및 π 접합 시스템3의 후속 확장에 의해 적색 발색단으로 광변환될 수 있는 녹색 발색단을 형성하는 His-Tyr-Gly 트리펩티드 서열로 인해 UV 또는 청색광에 노출되면 녹색에서 적색으로 전환될 수 있습니다. PCFP와 단량체 변이체는 각각세포 6-10을 추적하고 단백질 역학11-14를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 최근 몇 년 동안 PCFP는 세포 운명 추적을 위해 제브라피시6, 닭7, 8 및 마우스9, 10과 같은 다양한 동물 모델에서 발현되었습니다. 여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아에서 PCFP의 세포 특이적 광변환과 후기 발달 단계에서 광변환된 단백질의 추가 추적을 위한 프로토콜을 보고합니다. 이 방법론을 사용하면 제브라피시 동물 모델에서 형태 형성의 기저에 있는 세포 생물학적 사건을 조직 특이적 방식으로 연구할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 광변환 분석을 위한 배아 얻기

PCFP를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 교배 시 가장 밝은 동형접합체 배아를 선택하고 원하는 배아단계 15까지 28.5°C에서 성장합니다.

참고 1: 이 사전 선택은 낮은 레이저 출력으로 배아를 스캔할 수 있도록 하여 광독성 및 광백화를 방지합니다.

참고 2: 배아를 시각화할 때 저강도 빛을 사용하고 Kaede 및 KikGR과 같은 PCFP가 일광을 포함한 빛 노출에 민감도가 높기 때문에 어두운 조건에서 유지하는 것이 좋습니다.

2. 임베딩

  1. 달걀 물이 담긴 유리 용기에서 집게를 사용하여 실체 현미경으로 배아를 탈환합니다.
  2. 탈피온 배아를 0.16mg/ml 트리카인(3-아미노 벤조산 에틸에스테르, 시그마-알드리치) 용액(E3 배지 1ml 1X 중 4mg/ml 원액 40μl)으로 옮겨 배아를 마취합니다.

참고 1: 배아 손상 위험을 최소화하기 위해 유리 피펫 또는 절단 팁(P1000)으로 배아를 이식합니다.

참고 2: 난자는 기계적 스트레스를 받으면 쉽게 파열되기 때문에 어린 탈척 배아는 공기에 노출되거나 물/공기 경계면까지 들어 올려서는 안 됩니다.

  1. 마취된 배아를 배양 접시의 덮개로 옮기고 배아를 가능한 가장 작은 부피의 배지 내에서 유지합니다.
  2. 0.16 mg/ml Tricaine을 함유한 30°C에서 1% 저용융 온도의 아가로스(LMA, Lonza)로 배아를 피펫팅하여 배아를 아가로스로 옮기고, 유리 바닥이 있는 덮개 배양 접시(MatTek Corp., Ashland, MA, USA)의 커버 유리에 놓습니다. 그런 다음 부드러운 플라스틱 팁(예: 절단 Microloader Pipette Tip, Eppendorf)을 사용하여 배아의 방향을 정하고 LMA가 중합되면 0.16mg/ml Tricaine 용액으로 아가로스를 덮습니다.

참고 1 : 60 °C에서 1 % LMA를 용융하고 30 °C에서 용융된 아가로스를 유지하십시오.

3. 사진 변환

  1. Zeiss LSM 710과 같이 405nm, 488nm 및 561nm 레이저 소스가 장착된 도립 컨포칼 현미경에서 488nm 레이저(즉, 30mW Ar 레이저, 5-7% 강도, 검출기 493-540nm로 설정) 및 561nm 레이저(즉,, 10mW DPSS 561 레이저, 7-9% 강도, 검출기 587-651로 설정)을 사용하여 조직/기관에서 광전환성 단백질의 녹색 및 적색 형광을 각각 스캔합니다.

참고 1: 사진 변환 전 스캔의 경우 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 대물렌즈를 사용했습니다.

참고 2: 실수로 생성된 빨간색 변환된 PCFP가 존재하는지 배제하기 위해 실험 전에 항상 적색 형광을 스캔하십시오.

  1. 시계열 도구를 선택하고 간격 없이 2개의 주기로 설정합니다(하나는 사전 사진 변환용이고 다른 하나는 사후 사진 변환용).
  2. 영역 도구를 선택하고 사진 변환을 위해 하나 이상의 관심 영역(ROI)을 정의합니다.

참고 1: 세포 또는 단백질의 이동이 예상되지 않는 고정된 표본에서 세 가지(xy 및 z 방향) 모두의 광변환된 조직/세포의 면적을 측정하여 ROI에서 스캐닝 레이저에 의해 실제로 광변환된 영역이 소프트웨어에서 선택한 ROI와 일치하는 정밀도를 먼저 결정하는 것이 좋습니다. 이 응용 프로그램에 설명된 설정의 경우 ROI는 광 변환 영역과 매우 정밀하게 일치했지만 이는 사용된 대물렌즈와 광 변환에 적용된 레이저의 양에 따라 다릅니다. ROI의 크기는 대물렌즈의 개구수, 확대/축소 계수 및 광변환에 사용되는 레이저 광의 양에 따라 단일 셀의 크기로 줄일 수 있습니다.

  1. 표백 도구를 선택하고 1/2 스캔 후 표백 시작을 설정합니다. 우리는 광변환을 위해 30mW 405nm 다이오드 레이저를 사용했으며, 레이저 광의 강도, ROI의 스캔 반복 횟수 및 픽셀 시간(즉, 스캔 속도)을 변경하여 대부분 달성되는 완전한 광변환에 필요한 최소한의 레이저 광에 맞게 신중하게 최적화했습니다.

참고 1: 사진 변환을 위해 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 대물렌즈를 사용했습니다.

참고 2: 레이저의 출력과 반복 횟수는 각 실험 설정에 대해 경험적으로 결정되어야 하며 광독성을 줄이기 위해 필요한 최소한의 레이저 광으로 ROI 내에서 녹색에서 빨간색 PCFP로 완전한 광 변환을 보장해야 합니다. 낮은 레이저 출력(예: 3%, 목표 계획에서 0.03mW에 해당)과 낮은 반복 횟수(예: 20)를 사용하여 테스트를 시작하고, 이후에 10% 레이저 출력(목표 계획에서 0.1mW에 해당)인 완전한 광 변환이 달성될 때까지 레이저 출력을 높이는 것이 좋습니다. 이러한 조건 하에서, 검사된 모든 배아는 치료 계획에서 살아남았다. 그럼에도 불구하고, 우리는 난황 막이 레이저 펄스에 민감하고 쉽게 손상되어 배아를 죽일 수 있음을 관찰했습니다. 이러한 이유로 표적 조직의 위치가 난황체에 가까울 경우 광변환 후 배아 치사율이 발생할 수 있습니다.

  1. 488nm 및 561nm의 레이저를 사용하여 z-Stack으로 샘플을 스캔하여 PCFP의 남아 있는 녹색 및 광변환된 적색 형광을 시각화합니다.

참고 1 : 사진 변환 후 스캔의 경우 Plan Apochromat 20x / NA 0.8을 사용했습니다.

4. 아가로스에서 배아 제거

  1. 용액을 버리고 바늘이나 부드러운 플라스틱 팁을 사용하여 1% LMA에서 배아를 조심스럽게 제거합니다.
  2. 원하는 발달 단계가 될 때까지 28.5°C의 어두운 곳에서 배아를 난자에 담근 상태로 유지합니다.

참고 1: 배아가 난수에서 발달을 계속하는 것이 중요하며, 특히 배아가 발달하는 동안 발달 첫날 동안 발달을 계속하는 것이 중요합니다. 실제로, 일부 배아 조직/기관은 발달 중에 위치가 변경되므로 관심 있는 특정 조직/기관 및 원하는 분석 발달 단계에 따라 임베딩 중에 특정 방향이 필요합니다.

5. 재임베딩

  1. 이 프로토콜의 2)와 같이 진행하십시오.

6. 후기 배아 단계에서 광변환 조직 추적

  1. 녹색 및 적색 형광 신호에 대해 각각 488nm 및 561nm의 레이저를 사용하여 관심 영역(z-Stack)을 스캔합니다.

참고 1: 사진 변환 후 x 시간 스캔의 경우 Plan Apochromat 20x/NA 0.8을 사용했습니다.

참고 2: 이 프로토콜은 배아의 정상적인 발달에 영향을 미치지 않기 때문에 발달의 후반 단계에서 광변환된 배아를 관찰할 수 있습니다(이를 위해 4 - 6번 항목에 설명된 대로 진행).

7. 대표 결과

광변환 분석의 예가 그림 1에 나와 있습니다. 우리는 제브라피시 발달 중 내피 세포를 추적했습니다(발달 중인 제브라피쉬의 혈관 해부학적 구조에 대한 검토는16 참조). 이에 따라 내피핵17 내에서 KikGR을 발현하는 제브라피시 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 리포터 라인을 사용했습니다. 동형접합적이고 밝게 발현하는 배아를 수정 후 48시간(hpf)까지 28.5°C에서 키웠습니다. 결핵 형성 시, 배아를 마취하고 LMA에 삽입하여 배아의 전방-등쪽을 커버 유리쪽으로 배치하여 머리 혈관을 더 잘 시각화했습니다. 405nm, 488nm 및 561nm에서 작동하는 레이저가 장착된 도립 컨포칼 현미경(Zeiss LSM 710 Meta)과 광변환 분석 및 광변환 단백질의 추가 추적을 위해 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 대물렌즈를 사용합니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 광변환 전에 KikGR은 내피 조직 내에서 발현되었으며 488nm 아르곤 레이저를 사용해야만 녹색 형광으로 검출할 수 있었습니다. 적색 형광을 위한 561nm DPSS 561-10 레이저를 사용한 대조군 스캔은 광변환 전에 광변환된 KikGR을 감지하지 못했습니다(그림 1A). 그 후, ROI는 405nm 다이오드 레이저(10% 강도, 20회 반복)를 사용하여 완전히 광변환되었으며 488nm 및 561nm 레이저를 사용하여 헤드 혈관을 다시 스캔했습니다(그림 1B). 그림 1B에서 볼 수 있듯이 녹색 KikGR은 ROI 내에서 빨간색으로 완전히 전환되었습니다. 광변환 분석 후, 배아를 아가로스에서 제거하고 난수에서 28.5°C에서 배아를 배양했습니다. 마지막으로, 배아는 후기 단계에서 광변환된 내피 세포를 추적하기 위해 광변환 후 24시간 후(약 72hpf)에 다시 관찰되었습니다(그림 1C). 따라서, 배아를 LMA에 삽입하고, 488nm 및 561nm 레이저를 사용하여 샘플을 다시 스캔했습니다. 그림 1C에서 볼 수 있듯이, 광변환된 ROI에서 발생하는 내피 조직 내에서 적색 형광 광변환 KikGR의 안정성과 새로운 녹색 비광변환 KikGR의 재합성으로 인해 비변환 및 광변환 KikGR 단백질이 모두 관찰되었습니다.

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그림 1. 제브라피시 개발 중 KikGR의 광변환. (A,B) Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 형질전환 배아에서 내피두(endothelial head vasculature)의 특정 부위를 48 hpf로 광변환하였고, (C) 광변환 후 24시간(약 72 hpf)에 다시 관찰하였다. KikGR(녹색), 광변환된 KikGR(빨간색) 및 병합된 채널의 형광이 표시됩니다. 점선 원은 사진 변환 전, 후 및 24시간 후의 ROI를 보여줍니다. 이미지는 제브라피시 배아의 등쪽 모습으로, 아래쪽 앞쪽에 있습니다. 눈금 막대 : 50μm.

<테이블 테두리="1"> 단백질(약어) 전(nm) 엠 (nm) EC 퀀텀 Quaternary 구조 밝기 신청 참조 Kaede_G 508의 518의 99분 0.9 호 테트라머 259의 셀 추적 2,6 Kaede_R 572명 580명 60의 0.3 테트라머 59분 KikGR_G 507의 517의 54분 0.7 테트라머 112의 셀 추적 3,6,8-10 KikGR_R 583의 593의 35분 0.6 테트라머 68의 mKikGR_G 505의 515의 49분 0.7 단위체 101호 동적 추적 초해상도 이미지 13 mKikGR_R 580명 591의 28분 0.6 단위체 53분 EosFP_G 506명 516의 72의 0.7 테트라머 150명 셀 추적 5,20 EosFP_R 571명 581의 41의 0.5 테트라머 67의 tdEos_G 506명 516의 34의 0.7 탠덤 다이머 165의 초해상도 이미지 12,14,21 tdEos_R 569의 581의 33분 0.6 탠덤 다이머 59분 mEos2_G 506명 519의 56분 0.7 단위체 140의 동적 추적 초해상도 이미지 11,18 mEos2_R 573명 584명 46의 0.7 단위체 90의 Dendra2_G 490의 507의 45의 0.5 단위체 67의 동적 추적 초해상도 이미지 4,11 Dendra2_R 553의 573명 35분 0.55 호 단위체 57분

표 I. 광변환성 형광 단백질의 특성. 각 PCFP의 일반적인 이름 및/또는 약어와 함께 피크 여기(Ex) 및 방출(Em) 파장, 몰 흡광 계수(EC, 10-3 M-1 cm-1 ), 양자 수율(QY), 생리학적으로 관련된 4차 구조, 상대 밝기(EGFP의 %), 응용 프로그램 및 참조가 표에 나와 있습니다. Day and Davidson, 2010에서 발췌한 표1.

<테이블 테두리="1"> 증권 시세 표시기 제브라피시 형질전환 라인 근원 카에데 Tg(elavl3:카에데)rw0130a 오카모토 랩 Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:카에데)   Tg(ins:카에데)   Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:카에데)   Tg(lhx5:카에데)b1204/+ 지르크 Tg(myl7:kaede)   Tg(올리그2:카에데)   Tg(UAS-E1B:카에데)S1999T 지르크 Tg(UAS:카에데)rk8 지르크 Tg(vsx2:카에데)nns2 히가시지마 연구실 KikGR Tg(kdrl:nlsKikGR)   Tg(krt4:NTR-KikGR)   Tg(myl7:nlsKikGR)   Tg(sox10:KikGR)   Tg(UAS:KikGR)   EosFP Tg(sox10:EosFP)   Tg(sox10:nlsEosFP)   덴드라 Tg(-8mpx:덴드라2)   Tg(UAS:덴드라크라스)  

표 II. PCFP s를 발현하는 제브라피시 형질전환 라인. 제브라피시 모델 유기체 데이터베이스(ZFIN, http://zfin.org/)에서 얻은 데이터. Zebrafish International Resource Center(ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/)의 회선 가용성이 표시됩니다.

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근에는 Kaede 또는 KikGR과 같은 광전환성 단백질의 발현을 위한 형질전환 동물 모델이 생성되었습니다. 이 동물들은 정상적으로 발달하며, 이는 이러한 단백질이 배아 발달에 독성 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 동물 배아에서 세포를 추적하기 위한 광변환 분석에 대한 첫 번째 보고는 유비쿼터스 발현을 위해 Kaede를 암호화하는 mRNA 또는 DNA를 단일 세포 제브라피쉬 배아에 주입하거나 Gal4-UAS시스템을 사용하여 신경 조직에서 Kaede 및 KikGR을 발현함으로써 Hatta와 공동 연구자에 의해 수행되었습니다6. 그들은 세포 움직임과 신경 모양의 추적을 시각화할 수 있었으며, 이는 후뇌6에서 초기 교련 축삭의 신경형성, 플라코드 형성 및 탐색과 같은 형태 발생 과정을 따라갈 수 있는 이 도구의 다양성을 입증했습니다. 닭 모델에서 KikGR은 전기천공에 의해 신경관에 도입되고 신경능선 또는 신경관에서 광변환되어 병아리 배아8의 이동 흐름 내에서 신경능선 세...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

캐나다 토론토의 아픈 아동 병원에서 제브라피시 형질전환 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 라인을 친절하게 제공해 주신 Ian C. Scott 박사님께 감사드립니다. 컨포칼 및 2-포톤 현미경 Core Facility(Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine)와 Dr. Zoltan Cseresnyes, 탁월한 기술 지원 및 전반적인 이미징 지원. S.A.-S. 는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)의 하이젠베르크 펠로우십의 지원을 받습니다. 이 작업은 DFG 보조금 SE2016/7-1의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
재료:
물고기를 기르고 알을 모으는 데 필요한 장비(자세한 내용은 Zebrafish Book22 참조).
실체현미경LeicaLecia MZ6 실체현미경488nm
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경ZeissZeiss LSM 710 NLO488nm, 561nm 및 405nm에서 작동하는 레이저 장착
가열 블록
Dumont #5 집게
쌍 덮개 유리 바닥 배양 접시MatTek CorpAshland MA USA
마이크로로더 피펫 팁Eppendorf
Vortex
바늘
시약:
계란 물 매체
60 μ g/ml ddH2O
E3 매체
5mM NaCl
0.17mM KCl
0.33mM CaCl2
0.33mM MgSO4
0.00001% (w/v) 메틸렌 블루
4 mg/ml 트리카인 원액
400 mg 트리카인(3-아미노 벤조산 에틸에스테르)시그마-알드리치
97.9 ml ddH2O
2.1 ml 1M Tris (pH9)
pH 7에서 조정, 부분 표본 및 저장 -20 ° C
1 % LMA (저융온 아가 로스, Lonza) < / em>
1g LMA / 100 ml E3 매체 1X
부분 표본 및 4 °deg에서 보관; 씨

참고문헌

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