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방법 논문

에 대한 바이러스 나노 입자

17K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/4352

⸱

2012년 11월 16일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

이 논문에서

요약

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

초록

나노 소재의 사용은 재료 과학 및 의학에 혁명을 할 수있는 가능성이 있습니다. 현재, 서로 다른 나노 입자의 수​​는 이미징 및 치료에 응용 프로그램에 조사하고 있습니다. 식물에서 파생 바이러스 성 나노 입자 (VNPs)가 정의 크기와 모양으로 자기 조립 bionanomaterials으로 간주 할 수 있습니다. Steinmetz 연구실에서 조사중인 공장 바이러스는 직경 30 nm의 아르 둘 다 Cowpea 모자이크 바이러스 (CPMV)와 Brome 모자이크 바이러스 (BMV)에 의해 형성 icosahedral 입자가 포함되어 있습니다. 우리는 또한 다음과 같은 식물 바이러스로부터 파생 된 막대 모양과 filamentous 구조를 개발하고 있습니다 : 18 나노 미터로 300 nm의 크기, 그리고 filamentous 입자 515를 형성 감자 바이러스 X (PVX)로 강성 봉을 형성 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 길이, 폭 13 나노 미터의 나노 미터는 (독자는 심판이 판결이라고합니다. VNPs에 대한 자세한 내용은 1, 2).

planta에 대규모로 쉽게 제작 할 수 매우 안정적이고 biocompatible 있습니다. 또한, VNPs는 특히 유전자 변형 또는 화학 bioconjugation 방법 3을 사용 설계 할 수 있습니다 "프로그램"단위입니다. VNPs의 구조는 원자 해상도로 알려져 있으며, 수정은 원자 레벨 4, 현재의 최첨단 기술과 합성 나노 소재를 사용하여 달성 할 수없는 제어 수준의 공간적 정밀도로 수행 할 수 있습니다.

이 논문에서, 우리는 CPMV, PVX, TMV, 그리고 Vigna ungiuculata와 Nicotiana benthamiana 공장에서 BMV의 전파에 대해 설명합니다. 각 VNP에 대한 추출 및 정제 프로토콜은 주어집니다. 정화되고 화학적으로 라벨이 표시된 VNPs의 특성에 대한 방법은 설명되어 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 채널에 초점을emical fluorophores과 VNPs의 라벨 (예를 들면, 알렉사 형석 647) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 염료는 추적 및 5-10 VNPs의 확인을 용이하게하고, 자신의 pharmacokinetics 8,11을 향상하는 동안 PEG는 proteinaceous 나노 입자의 immunogenicity을 감소시킨다. 우리는 마우스 이종 이식 종양 모델을 사용 PEGylated VNPs의 유도 종양을 보여줍니다. 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 조직 예 생체의 형광 이미징, 균질 조직의 형광 정량화하고, 공 촛점 현미경의 조합이 biodistribution을 연구하는 데 사용됩니다. VNPs는 reticuloendothelial 시스템 (RES)를 통해 해제되며, 추적 종양이 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과를 통해 수동적으로 12 달성된다. VNP의 나노 기술은 강력한 플러그 앤 플레이 이미지에 기술하고 생체 내 질병의 사이트를 취급합니다. 우리는 더에 약물 cargos 및 임상 - 관련 영상 moieties뿐만 아니라 조직 별 리간드를 수행 할 VNPs를 개발하고 있습니다암과 심장 혈관 질환에 overexpressed 분자 수용체를 타겟팅합니다.

프로토콜

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 전파

  1. 실내 식물 챔버 하루 15 시간 (100 % 등, 25 ° C, 65 % 습도)와 밤 9 시간 (0 % 등, 22 ° C, 60 % 습도)에 제어합니다.
  2. 표 1의 타임 라인에 따라 식물의 예방.
CPMV PVX, TMV, 그리고 BMV
일 0 : 공장 3 cowpea 씨앗 / 화분. 일 0 : 공장 ~ 30 N. benthamiana 씨 / 냄비. 1 큰술 비료 / 5 L의 물을 일주일에 한 번 비옥.
일 14 : 1 공장 / 냄비에서 다시 냄비 N. benthamiana.
10 일 : 감염은 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 CPMV (5 μg/50 μl / 잎)를 기본 잎을 남긴다. 일 28 : 감염 3 F필자는 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 PVX, TMV, 또는 BMV (5 μg/50 μl / 잎)로 출발합니다.
일 20 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C. 일 42 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C.

성장 감염, 그리고 잎을 수확을위한 표 1. 타임 라인.

참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 정화

참고 : 모든 단계는 얼음 또는 4에서 수행되는 ° C.

  1. 추위 버퍼 2 볼륨을 (표 2 참조)를 사용하여 표준 믹서기에서 냉동 잎 100g을 균질화. 일종의 투박한 무명로부터 2-3 층을 통해 필터링 할 수 있습니다.
  2. PVX를 들어, 1 M HCL을 사용하여 6.5에 pH를 조정합니다. 0.2 % (w / V) 아스코르브 산 및 0.2 % (w / V) 나트륨 sulfi을 추가테.
  3. 20 분에 5,500 XG에서 원유 공장 homogenate를 원심 분리기. 표면에 뜨는 수집합니다.
  4. BMV를 들어, 레이어 10 % (w / V) 자당 솔루션의 5 ML 이상 표면에 뜨는 25 ML. 38.5 % CsCl 용액 (w / V)의 3 시간과 resuspend 펠릿을위한 9,000 XG에서 원심 분리기. 5 시간에 진동에 의한 혼합 한 다음 단계 2.12를 계속합니다.
  5. 1시 1분 (V / V) 클로로포름 :1-부탄올의 0.7 볼륨을 추가하여 식물 자료를 추출합니다. 30-60 분 동안 혼합물을 저어.
  6. 20 분에 5,500 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 위 수성 단계를 수집합니다.
  7. 0.2 M와 8 % (w / V) PEG (MW 8000)에 NaCl을 추가합니다. TMV의 경우도 (V / V) 트라이 튼 X-100 1 %를 추가 할 수 있습니다. 적어도 1 시간에 저어, 최소한 1 시간에 앉아 보자.
  8. 15 분에 15,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 버퍼의 10 ML에 Resuspend 펠릿. PVX를 들어, 0.5 M.에 0.1 % β-메르 캅토 에탄올 및 요소를 추가
  9. 30 분에 8,000 XG에 원심 분리기와 표면에 뜨는 수집합니다.
  10. 3 시간에 160,000 XG에 표면에 뜨는을 Ultracentrifuge. 5 ML 버퍼 O에 Resuspend 펠릿vernight.
  11. 동일한 10 % 권, 20 %, 30 %, 및 버퍼에 40 % 자당을 (무거운 첫 번째)를 사용하여 10-40%의 자당 기울기를 준비합니다. 기울기가 실온에서 하룻밤 평형 할 수 있습니다.
  12. Ultracentrifuge은 2 시간 (BMV 24 시간)에 100,000 XG에서 자당 기울기를 통해 펠릿을 resuspended.
  13. 광 분산 밴드를 수집하고 버퍼에 대한 dialyze.
  14. 4에 VNPs (아래)와 상점을 특징 ° C. 장기 저장을 위해, -80에 저장 ° C.를
CPMV 및 TMV 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0)
38.5 MM KH 2 PO 4
61.5 MM K 2 HPO 4
PVX 0.5 M borate 버퍼 (산도 7.8)
0.5 M 붕소의 산성
NaOH로 pH를 조정
BMV 사마 버퍼 (산도 4.5)
250 MM 나트륨 아세테이트
10 MM MgCl 2
이 MM β-메르 캅토 에탄올 (신선한 추가)

표 2. 각 VNP에 대한 버퍼 및 요리법.

참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 특성

  1. VNPs의 농도를 결정하기 위해 UV / 눈에 보이는 분광을 수행합니다.
    1. NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 샘​​플 2 μl의 흡광도를 측정합니다.
    2. 맥주 램버트 법을 사용하여 입자와 염료의 농도를 결정 (A는 흡광도입니다 A = εcl, ε 흡광 계수이며, C는 농도이며, 전 경로 길이입니다.) 경로 길이는 NanoDrop에 0.1 cm입니다.
      VNP 별 흡광 계수는 다음과 같습니다
      CPMV : 8.1 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
      PVX : 2.97 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
      TMV : 3.0 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
      BMV : 5.15 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
  2. 크기 제외 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)에 의해 입자를 분석합니다.
    1. Superose 6 크기 배제 컬럼과 악타 익스플로러, 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0) 200 μl에 VNPs의 부하 50-100 μg을 사용합니다.
    2. 260 나노 미터 (핵산), 280 nm의 (단백질), 그리고 연결된 염료의 여기 파장에 감지기를 설정합니다.
    3. 72 분 동안 0.5 ML / 분의 유량으로 실행합니다.
    4. 용출 프로필과 A260 : A280 나노 미터는 VNP 준비가 순수 여부와 입자가 온전하고 조립 있는지 여부를 나타냅니다.
      다음 A260 : 280 비율이 순수한 VNP 준비를 나타냅니다 :
      CPMV : 1.8 ± 0.1
      PVX : 1.2 ± 0.1
      TMV :1.1 ± 0.1
      BMV : 1.7 ± 0.1
  3. 개별 코트 단백질에 준비 및 활용의 순도를 분석 할 (예정 주물 NuPAGE) 비스 - 트리스의 polyacrylamide 4-12% 기울기 겔 전기 영동을 denaturing 수행합니다.
    1. 인산 칼륨 버퍼의 9 μl에있는 입자의 10 μg에 4X LDS 샘플 버퍼 3 ML을 추가합니다. 이황화 채권의 높은 수를 줄이기 위해 BMV에 4X LDS 샘플 버퍼와 β-메르 캅토 에탄올 3 μl의 추가 1 μl를 추가합니다.
    2. 100 5 분에 열 블록에 품다 ° C.
    3. SDS 젤에 샘플을로드합니다.
    4. 버퍼를 실행 1X 걸레에 1 시간에 대해 200 V에서 샘플을 실행합니다.
    5. 형광 코트 단백질을 시각화하기 위해 UV 빛 아래에있는 젤을 문서화.
    6. 비 형광 단백질의 경우 1 시간에 Coomassie 블루 (0.25 % (w / V) Coomassie 브릴리언트 블루 R-250, 30 % (V / V) 메탄올, 10 % (V / V) 아세트산 산)와 얼룩.
    7. 밤새 30 % 메탄올, 10 % 아세트산과 Destain. 찬GE는이 솔루션이 필요합니다.
    8. 하얀 빛 아래 젤을 문서화.
  4. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의한 입자의 무결성을 분석합니다.
    1. 0.1-1 MG / DI 물을 20 μl의 ML에 샘플을 희석.
    2. Parafilm에있는 샘플의 20 μl 방울을 넣으십시오.
    3. TEM 그리드와 방울을 커버 2 분 동안 앉아 보자. 필터 종이 그리드에 초과 솔루션을 위크.
    4. 드라이 wicking 후 DI 워터 드롭 배치하여 격자를 씻으십시오.
    5. 2 % 20 μl 드롭 (w / V) 2 분에 대한 uranyl 아세트산에 배치하여 격자를 청바지. 필터 종이 얼룩 초과를 위크.
    6. 물에 한 번 더 그리드를 씻으십시오.
    7. 전송 전자 현미경으로 격자를 관찰.

4. PEG와 Fluorophores, 정제 및 특성과 VNPs의 화학 결합

  1. 아래의 반응에 대한 계산은 VNPs의 몰 질량은 다음과 같습니다
    CPMV : 5.6X 10 6 G / 몰
    PVX : 35 X 10 6 G / 몰
    TMV : 41 X 10 6 G / 몰
    BMV : 4.6 X 10 6 G / 몰
  2. 한 단계 N-하이드 록시 succinimide 커플 링 반응을 이용하여 CPMV과 PVX의 표면 lysines에 염료와 PEG를 공액 : 알렉사 형석 647 succinimidyl 에스테르 및 4500 등가물의 2500 몰 등가물 (모든 어금니 과도한는 VNP 당 어금니를 초과 참조) 추가 NHS를 PEG (MW 5,000) 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼에 CPMV에 DMSO에 용해. PVX와 함께 작업 할 경우 NHS-염색 및 NHS-PEG의 만 몰 초과를 추가합니다. CPMV와 PVX의 최종 농도가 2 밀리그램 / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 빛으로부터 보호 상온에서 반응 혼합물은 하루 아침에 품다. CPMV 및 PVX는 각각 300 및 1270 번지 lysines 있습니다. (독자가에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다CPMV 및 PVX의 화학 수정 : 13-15).
  3. diazonium 커플 링에 의한 TMV의 tyrosines에 공액 염료와 PEG는 구리 (I) 촉매 azide - alkyne cycloaddition이 나타납니다.
    1. 0.3 M P-toluenesulfonic의 산성 일 수화물, 3.0 M의 아질산 나트륨의 25 μl, 그리고 0.68 M 소주 1 시간에 대해 4 ° C에서 아세토 니트릴에 용해 3 ethynylaniline의 75 μl 400 μl를 혼합하여 diazonium 염 (alkyne)를 준비합니다.
    2. TMV의 1.25 ML (20 MG / ML 주식 솔루션)에 NaCl 100 MM를 포함하는 borate 버퍼, 산도 8.8의 3.3 ML를 추가합니다.
    3. alkyne 결합이 diazonium 커플 링으로 TMV에 처리 추가하는 3 시간에 얼음 욕조에서 diazonium 염 (alkyne) 솔루션 450 μl로 TMV를 반응한다. 이 솔루션은 밝은 갈색 컬러로 돌아갈 것입니다. TMV는 활용을위한 2140 사용할 수 tyrosines 있습니다.
    4. 단계 4.4에 설명 된대로 자당의 쿠션을 사용하여 최종 제품을 정화.
    5. azide - 기능 알렉사 형석 647 및 PEG-azide (MW 5,000) 쓰겠다고를 첨부g의 구리 (I) 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (CuAAC). 1 ㎜ CuSO 4, 2 MM의 AMG, 그리고 15 분 동안 실온에서 2 MM 나트륨 아스 코브 산으로 코트의 단백질과 품다 당 염료 및 PEG-azide 2 동등을 추가합니다. TMV의 최종 반응 농도가 2 밀리그램 / ML이라는 버퍼 볼륨 등 조정합니다. (: 16,17 리더는 TMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.)
  4. lysines 및 BMV 시스테인 돌연변이 (cBMV)의 cysteine​​s에 PEG에 염료를 변화시키다 :
    1. 0.1 M TNKM 버퍼 (50 MM 트리스베이스, 50 MM NaCl, 10 MM KCl, 5 MM MgCl 2, 산도 7.4)에 cBMV에 DMSO에 용해 오레곤 그린 488 succinimidyl 에스테르 2,000 몰 동등을 추가합니다. BMV의 최종 농도가 1 MG / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 4에서 하룻밤 반응 혼합물을 품어 ° C 빛으로부터 보호되고 있습니다.
    2. centri를 사용하여 정화 입자같은 fugal 필터는 단계 4.4에 설명되어 있습니다.
    3. 이전과 동일한 반응 조건을 사용하여 PEG-maleimide (MW 2000)의 2000 몰 초과를 추가하고 4시에 2 시간의 반응 혼합물을 품어 ° C. cBMV 180 반응 lysines과 cysteine​​s 있습니다. (: 18 리더는 BMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.)
  5. 정제 : 2.5 시간에 160,000 XG의 40 % (w / V) 자당의 쿠션을 통해 솔루션을 전달합니다. 버퍼에 펠렛를 다시 분해. 또한, 10 kDa 컷 - 오프 스핀 필터를 사용 적절한 버퍼에 대한 dialyze.
  6. 특성화 : PEGylated과 휘황-라벨 VNPs은 위에서 설명한 방법 사용 분석 : 표시 / UV 분광, SDS 겔 전기 영동, FPLC, 그리고 TEM (미도 그러나,도 6 및 7 참조).

5. 마우스 이종 이식 모델을 사용하여 종양 타겟팅 및 이미징

  1. 문화 HT-29 RPMI 매체에서 인간 대장 암 세포는 175cm이 세포 배양 플라스크를 사용하여 5 % CO 2 5 % FBS, 37시 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신, 그리고 1% L-글루타민 ° C로 보충.
  2. 5 분에 37 ° C에서 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 5 ML과 잠복기에 의해 멸균 PBS와 수확을 두 번 세포를 씻으십시오. RPMI 매체의 5 ML과 트립신을 비활성화. 5 분 500 XG에 centrifuging하여 세포를 수집합니다. 4에 5x10 6 cells/50 μl 매체 (trypan 파랑과 hemocytometer를 사용하여 총 세포 수를 결정)에 신선한 RPMI에서 ° C와 resuspend. 주사 (모든 솔루션 및 시약은 멸균 유지) 이전에 matrigel의 동일한 볼륨으로 섞는다.
  3. 조달 6 주 이전 NCR 뉴 / 뉴 마우스, 2 주 알팔파 무료로 다이어트를을 유지하고 있습니다. [참고 :. 모든 동물 절차는 IACUC 승인해야합니다]의 피하 주입하여 종양 xenografts을 유발 5x10 6 cells/100 멸균 18 2분의 1 게이지를 사용하여 측면에서 μl / 종양 (2 종양 / 마우스)바늘. 정기적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정하고 종양 20mm 3 (향후 12 일 이내)의 평균 볼륨으로 성장 할 수 있습니다. PBS와 VNP (N = 3 동물 / 그룹 / 시간 점) : 무작위로 두 개의 서로 다른 그룹에 쥐를 지정합니다. 1 ML 28 게이지 인슐린 주사기를 사용 정맥 주사 멸균 PBS의 꼬리 정맥 주입 100 μl 또는 10 밀리그램 / kg V​​NP 제제에 의해 관리 할 수​​ 있습니다.

참고 : 라이브 동물과 조직 문화 실험과 연구가 증명되지 않습니다. 손 -에 시범 조직 처리 및 데이터 수집으로 제한됩니다. HT-29 종양의 이종 이식 모델에서 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. 19

세 기술은 VNPs의 유도 종양을 평가하는 데 사용됩니다 :

  1. CO 2를 사용하여 다른 시간 지점 (2, 24, 72 시간)에 희생 마우스 : 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징가스. 측면에있는 종양과 함께 동물과 소비세 모든 주요 기관 (뇌, 심장, 폐, 비장, 신장, 간) 해부, parafilm에 조직을 배치하고, (800 밀리 노란색 여기와 방출 필터를 사용 형광 이미징 장비와 분석 조직에서 형광 신호 (VNPs에 복합 A647 레이블에서 파생)의 존재를 감지 노출). 이미지를 저장하고 ImageJ 1.44o 소프트웨어 (사용 형광 농도 분석 http://imagej.nih.gov/ij을 ). 시간이 주요 조직과 종양의 VNPs의 이해의 패턴을 비교합니다.
  2. 이미징 후, 반으로 각 조직을 잘라 cryo-sectioning 및 공 촛점 분석 10월 화합물에 반을 삽입 할 수 있습니다. 미리 무게 cryo-병에 나머지 절반을 수집하고 즉시 액체 N 2를 사용 동결. 스토어 -80 ° C에서 추가 처리를위한 준비가 될 때까지.
  3. 형광 정량화 : 재코드는 조직 가중치를. 실온에서 냉동 조직을 해동하고 PBS 1 ML을 포함하는 별도의 50 ML 팔콘 튜브에 배치합니다. 휴대용 조직 균질를 사용하여 PBS에서 2-3 분을위한 조직을 균질화 한 후 microfuge 튜브에 homogenate를 전송합니다. 비 무균 조직을 제거하는 13,000 XG에서 10 분의 homogenates을 원심 분리기.
  4. 384도 검은 색 UV 판에 각 그룹 (PBS 및 VNP 공법 / 시간 점)에서 조직의 표면에 뜨는의 Pipet 100 μl. 접시 리더를 사용하여 형광 강도를 (예 / EM 파장 665분의 600) 평가합니다. 조직 가중치에 의해 얻은 형광 값을 정상화.
  5. Immunohistochemistry : -20 ° C.에 cryo-마이크로톰 섹션 (10 μm)와 상점을 준비 세포 핵 (DAPI)과 내피 세포 마커 (CD31 항체 안티 - 마우스 FITC-라벨)에 대한 조직 섹션을 청바지. 휘황 - 라벨 VNP의 혈관과 간 tumoral 현지화를 매핑 할 공 촛점 현미경 분석을 수행s입니다.

참고 :이 절차는 증명되지 않습니다 대리인 데이터는 그림 8에 표시됩니다. immunohistochemistry와 설명 착색 방법에 대한 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. 19

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결과

식물 성장 비교 분석; 실험 설정, 잎 색 변화 연구, 황화 현상 방법.
그림 1. 식물 바이러스에 감염된 식물. CPMV에 감염된 Vigna unguiculata 식물 (A). PVX (B), TMV (C) 및 BMV (D)에 감염된 Nicotiana benthamiana 식물. 사진은 기계적 접종 후 약 10일째에 촬영되었습니다.

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토론

이 프로토콜은 생체 종양 이미징에 대한 VNPs 및 응용 프로그램의 화학 조작을위한 접근 방식을 제공합니다. 여기에 제시된 동물 형광 이미징, 형광 정량화 및 immunohistochemistry 기술 biodistribution을 공부하고 종양 추적 평가하는 데 유용합니다. 이 기술은 EPR 효과를 통해 종양에 나노 입자의 접근에 관한 귀중한 정보를 제공합니다. 다양한 분석 방법의 결과를 결합하여, 우리는 VNPs의 지역화와 biodistribution을 평가하기위한 강력한 방법을.

이러한 연구는 그러나 수행 할 수 있습니다 전에, 순수한 바이러스 준비를 얻기 위해 필수적입니다. 이외에도 기계 접종에서 VNP 전파에 대한 가능한 대안은 높은 변화와 축적 속도를 가질 수 agroinfiltration입니다. VNPs를 전파 할 때주의가 별도의 t와 같은 다른 바이러스에 감염된 식물을 유지하기 이동해야합니다교차 오염을 방지 O. 특히, TMV는 ...

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공개 사항

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH / NIBIB 보조금 R00 EB009105 (NFS로)와 P30 EB011317 (NFS에), NIH / NIBIB 훈련 보조금 T32 EB007509 (AMW에), 케이스 웨스턴 리저브 대학의 학제 연합 투자 기금 (NFS로)에 의해 지원되었다 및 사례 종합 암 센터 보조금 P30 CA043703 (NFS로). 우리는의 Steinmetz 연구실 학부 학생 연구원에게 감사 실질적인 지원 : 나디아 Ayat, 케빈 첸, Sourav (SID) 데이, 앨리스 양 샘 알렉산더, 크레이그 D' 크루즈 스티븐 왜가리, 로렌 랜돌프, 브라이언 그래서 바울 Chariou .

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
VNP 생산
실내 식물 생장 챔버Percival ScientificE-41L2
V. unguiculata 종자 (California black-eye no. 5)버피51771A
N. benthamiana 종자N. benthamiana 종자는 Salk Institute에서 제공받았습니다. 종자는 식물 증식을 통해 생산됩니다.
카보런덤FisherC192-500
Pro-mix BX 배양토Premier Horticulture713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite 비료JR Peters77860
장비
50.2 Ti 로터Beckman337901
SW 32 티타늄 로터Beckman369694
Optima L-90K 초고속 원심분리기Beckman365672
SLA-3000 로터Thermo Scientific07149
SS-34 로터Thermo Scientific28020
Sorvall RC-6 Plus 원심분리기Thermo Scientific46910
폴리프로필렌 병Beckman355607SLA-3000 로터용
폴리카보네이트 병Beckman357002SS-34 로터용
초투명 튜브Beckman344058수크로스 밀도 구배 및 SW 32 Ti 로터용
폴리카보네이트 병Beckman355618펠릿팅 및 50.2 Ti 로터용
NanoDrop 분광광도계Thermo ScientificNanoDrop2000c
PowerEase 500 프리캐스트 겔 시스템InvitrogenEI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) 크기 배제 크로마토그래피 컬럼GE Healthcare17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 크로마토그래프GE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12RBeckman392302벤치탑 원심분리기
크라이오스탯LeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life Sciences생체 내(In vivo) 영상 시스템
조직 파쇄기Biospec Products985370-395
마이크로플레이트 리더TecanInfinite-200
투과 전자 현미경ZEISSLibra 200FE
FluoView 레이저 스캐닝 공초점 현미경OlympusFV1000
화학 물질 및 시약
3-에티닐아닐린Sigma Aldrich498289-5G
384-웰 블랙 플레이트BD Biosciences353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS 겔InvitrogenNP0321BOX
4X LDS 샘플 버퍼InvitrogenNP0008
아세트산FisherA385-500
아세토니트릴Sigma Aldrich271004-1L
Alexa Fluor 647 azideInvitrogenA10277
Alexa Fluor 647 카복실산, 숙신이미딜 에스테르InvitrogenA20006
Amicon Ultra-0.5 ml 원심분리 필터MilliporeUFC50109610 kDa 분자량 컷오프
아미노구아니딘 염산염Acros Organics36891-0250
붕산FisherA74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250FisherBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
디메틸 설폭사이드FisherBP231-100
거름종이Fisher09-801KP5 등급
FITC 표지 항-마우스 CD31 항체BioLegend102406
염소 혈청Invitrogen16210-064
KClFisherBP366-500
L-아스코르빈산 나트륨염Acros Organics35268-0050
메탄올FisherA412P-4
MgCl₂2FisherBP214-500
현미경 슬라이드Fisher12-544-3
현미경 커버 글라스VWR48366-277
MOPS 완충액InvitrogenNP0001
mPEG-mal나노캡슐PG1-ML-2k분자량 2000
mPEG-N3나노결정PG1-AZ-5k분자량 5000
mPEG-NHS나노입자PG1-SC-5k분자량 5000
NaClFisherBP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester 6-이성질체InvitrogenO-6149
p-톨루엔술폰산 일수화물Acros Organics13902-0050
봉입제FisherSP15-100
인산수소칼륨FisherBP363-1
인산일칼륨FisherBP362-1
아세트산 나트륨FisherBP333-500
아질산나트륨Acros Organics42435-0050
아황산나트륨Amresco0628-500G
자당FisherS6-500
TEM 그리드Ted PellaFCF-400Cu
Tris baseFisherBP152-500
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-메르캅토–에탄올FisherO3446I-100
조직 배양
태아 송아지 혈청Invitrogen12483-020
혈구계수기Fisher0267110
HT-29 세포ATCCHTB-38
L-글루타민Invitrogen25030-080
인산완충생리식염수(PBS)Cellgro21-040-CV
페니실린-스트렙토마이신Invitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
조직 배양 플라스크Corning431080175 cm2
트리판 블루Thermo ScientificSV30084.01
트립신, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, 액상Invitrogen25300-054
동물 실험
18% 단백질 설치류 사료Harlan TekladTeklad Global 2018S알팔파 제거 식이
인슐린 주사기BD Biosciences32941028게이지
이소플루레인BaxterAHN3637
매트리젤 매트릭스 기저막BD Biosciences356234
NCR nu/nu 마우스CWRU 단과대학
의과대학 무균 동물 및 이종 이식 핵심 시설
멸균 주사기BD Biosciences30519618 1/2 게이지
Tissue-Tek CRYO-OCT 화합물Andwin Scientific4583

참고문헌

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