쥐의 뇌에서 F1FO ATP 합성 효소 복합체 충실 submitochondrial 소포를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 소포는 F1FO ATPase의 복잡하고 패치 클램프 녹음의 기술을 사용하여 변조의 활동의 연구를 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아는 신진 대사, 생존 1, 개발 및 칼슘 2 신호 등 많은 중요한 세포 기능에 참여하고 있습니다. 가장 중요한 미토콘드리아 기능의 두 ATP, 산화 인산화에 의한 세포의 에너지 통화 및 프로그램 된 세포의 죽음 3 신호 조정의 효율적인 생산에 관련되어 있습니다.
ATP의 생산을 주로 담당하는 효소는 ATP 합성 효소 4-5이라는 F1FO-ATP 합성 효소이다. 최근 몇 년 동안, 세포 자멸사 및 괴사 세포 죽음에서 미토콘드리아의 역할은 상당한 주목을 받고있다. 사멸 세포 죽음, 이러한 백스 같은 BCL-2 가족 단백질은 미토콘드리아 외막를 입력 올리고머 및 세포질 6에 직업 세포 사멸 인자를 방출, 외부 막을 permeabilize. 고전적인 괴사 된 세포의 죽음, 이러한 신경 세포의 허혈이나 excitotoxicity에,이 Larg에 의해 생성 된 것과매트릭스 칼슘 전자, 제대로 규제 증가는 내부 멤브레인 기공, 미토콘드리아 투과성 전이 기공 또는 MPTP의 개통에 기여하고 있습니다. 이 내부 막 탈분극 및 외부 막 파열, 직업 세포 사멸 인자의 릴리스 및 신진 대사 장애에 기여하고, 삼투압 변화가 발생합니다. BCL-XL 7을 (를) 포함하여 많은 단백질 F1FO ATP 합성 효소, 조절의 기능과 상호 작용합니다. BCL-XL은 F1FO ATP 합성 효소의 베타 소단위와 직접 상호 작용이 상호 작용 F1FO ATPase의 활성 8시 F1FO에 의한 H +의 그물 전송함으로써 증가하는 미토콘드리아의 효율성을 증가 F1FOATPasecomplex에서 누수가 전도성을 감소시킨다. ATP 합성 효소의 활동 및 변조를 연구하기 위해, 우리는 F1FO ATPase의를 포함한 설치류 뇌 submitochondrial의 소포 (연 소식 기화기)에서 분리. Alavian 등과 같이 연 소식 기화기는 F1FO ATPase의의 구조와 기능 무결성을 유지합니다. 여기, 우리는 방법을 설명우리는 쥐의 뇌에서 연 소식 기화기의 격리를 위해 성공적으로 사용하고 우리는 연 소식 기화기 (이온 누출 전도도) 채널의 활동을 분석 할 수있는 패치 클램프 기술을 묘사합니다.
프로토콜
1. 뇌 미토콘드리아 절연 (브라운 MR 등에서 적응. 9)
- 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 방법을 사용하여 쥐를 희생.
- 잘린 동물의 머리를 잘라 피부를 잘라 두개골을 노출합니다.
- 가위 또는 rongeur로 절단하여 부드럽게 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거합니다.
- 절연 버퍼에있는 소뇌 (표 1 참조)없이 정밀하게 뇌를 말하다 5 ML 유리 / 테프론 균질화 (장비 목록 참조)로 전송할 수 있습니다.
- 조직 가볍게 10 회 (거품 없음), 약 5 분 균질화.
- 4 10 분 ° C 벤치 탑 원심 분리기에서 1,500 × g에서 샘플을 원심 분리기.
- 상층 액을 저장 (미토콘드리아와 synaptosomes)와 펠렛을 (핵 물질 및 세포 파편) 폐기합니다. 벤치 탑 원심 분리기 ° C 4에서 10 분간 16,000 × g에서 원심 분리기.
- 폐기상층 액을 다시 중단 절연 버퍼 500 μL에 펠렛을. 세포 분열 용기 (장비 목록을 참조) synaptosomes을 방해. 빠른 압축 해제 한 다음 10 분, 1,200 PSI의 압력을 적용합니다.
- 126,500에서....
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결과
우리의 프로토콜의 첫 번째 단계는 그림 1과 서양 얼룩에 의해 그림과 같이 미토콘드리아 정제 분리 할 수 있습니다. 그림 2에서 두뇌 파생 submitochondrial 소포 패치 기록의 예를 보여줍니다. 내부 아웃 패치 구성을 사용하여 우리는 ATP에 의해 변조 채널 활동을 보여줍니다. 제어 (CTL) 녹음 (왼쪽) 평균 600 P의 최대 전도도와 멀티 전도성 채널 활동을 보여줍니다. 그 즉시 화장실에 ATP 1 ㎜의 추가에 따라 감소 하였다. ATP의 전반적인 효과는 농도 의존적으로 연 소식 기화기 패치의 전도성을 감소하는 것입니다. SMV 별도 H + 표시 ACMA의 형광 강도의 감소를 측정 그림 3과 같이 F1FO ATPase의의 효율성을 측정하기 위하여 차단 후, 우리는 ATP 가수 분해에 대한 응답으로 연 소식 기화기에 H + 이온의 움직임을 측정 하였다. ATP에 민감한 H + 연 소식 기화기에 이온 격리를 추가 한 후 .......
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토론
방법에서와 같이 본 발명이 방법으로 phenotypes.SMVspurified 세포의 구별없이 뇌 전체에서 2 단계 이후 단계 1 submitochondrial 소포 (연 소식 기화기)의 끝에서 다른 세포 내 소기관에 의한 오염이 필수적으로 순수 미토콘드리아의 분리를하는 수 기술 그림 1과 우리의 이전 작업 (Alavian KN 등. 8)와 이전의 동결 구조적 및 기능적 무결성을 유지합니다. 냉동 및 해동 후, 미토콘드리아 격리 또는 연 소식 기화기는 녹음 및 생화학 분석하는 데 사용됩니다,하지만 호흡 연구에.
이 방법은 또한 동일한 단계를 사용하여 간에서 미토콘드리아 분리 할 수 있습니다. 미토콘드리아와 연 소식 기화기는 전기 생리학 녹음 챔버에 도금 할 때 클러스터를 형성하는 경향이 있기 때문에,주의가 과도한 응집 과도한 희석로 샘플을로드하는 주어져야한다는 possibili을 줄일 수 있습니다인감 형성의.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PTFE 페스틀 포함 Potter-Elvehjem 조직 분쇄기 | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf 원심분리기 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 세포 파쇄 용기 | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| 폴리카보네이트 원심분리관 | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 로터 | Beckman Coulter | ||
| L8-70M 초원심분리기 | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| 매니퓰레이터 | Sutter Instrument | ||
| 붕규산 유리 모세관 | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러 모델 P-87 | Sutter Instrument |
참고문헌
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calci....
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재인쇄 및 허가
