방법 논문

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

DOI:

10.3791/4398

⸱

2012년 11월 2일

 , 
1Human Immune Monitoring Center, Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Stanford University

이 논문에서

요약

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CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의

초록

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최근 몇 년 동안, 단일 세포의 급속한 분석은 일반적으로 유동 세포 계측법과 휘황-라벨 항체를 사용하여 수행되었습니다. 그러나, 형광 방출의 스펙트럼 중복의 문제는 동시 프로브의 수를 제한하고 있습니다. 반면, 오히려 fluorophores보다 ICP-MS. 1 액체 단일 셀 도입 시스템 DVS 과학 커플의 새로운 CyTOF 질량 cytometer는 매우 강화 금속 동위 원소를 포함하는 킬레이트 화 고분자는 항체 또는 기타 특정 프로브에 연결된다. 2-5가 때문에 금속 순도와 질량 cytometer의 대량 해상도, 인근 동위 원소로부터 "스펙트럼 중복"은 없습니다, 따라서 보상 매트릭스 필요. 또한, 란탄 족 금속의 사용으로 인해, autofluorescence 대한 동등한 따라서 거기에는 생물학적 배경이 없습니다합니다. 원자 질량 103-203, 이론적으로 최대 100 레이블이 동시에 구별 할 수에 걸쳐 대량 창을 갖추고 있습니다. 현재, 35 개 이상의 채널 샘플 면역 프로파일의 전례 절개를 허용 DVS 과학에서 사용할 수있는 킬레이트 시약을 사용하여 사용할 수 있습니다. 6-7

대량 세포 계측법에 단점은 프로브 당 별도의 금속 동위 원소 (앞으로 또는 측면 분산 가능성이 이에 상응하는 금액),하고 파괴적인 기술 (복구를 정렬의 어떠한 가능성)이라는 사실에 대한 엄격한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 대량 cytometer의 현재 구성도 만의 셀 전송 속도 ~ 25 %, 따라서 세포의 높은 입력 번호를 필요가 있습니다.

대량 cytometer의 최적의 일일 실적은 몇 가지 단계가 필요합니다. 최적화의 기본 목표는 M 신호 강도를 줄이고 M 16에서 원하는 신호를 방해한다는 산화물 (M 16)의 형성을 최소화하면서 원하는 금속 동위 원소 (M)의 측정 신호 강도를 극대화하는 것입니다. 첫 번째 단계는 시스템 때문에 고온, 안정적 I을 따뜻하게하는 것입니다CP 플라즈마가 설립되었습니다. 둘째, 현재와 메이크업 가스 유량에 대한 설정은 매일 최적화해야합니다. 샘플 수집하는 동안, 최대 셀 이벤트 요금은 검출기 효율과 처리 속도 1,000 세포 / 초에 의해 제한됩니다. 그러나, 느린 셀 이벤트 속도 (300-500 셀 / 초)은 샘플의 품질에 따라 보통 셀 이벤트 사이하므로 더 나은 해상도가 doublets와 파편을 통해 그대로 singlets을 극대화 할 수 있도록하는 것이 바람직하다. 마지막으로 하루의 끝에 기계의 적절한 청소는 무료 금속에 의한 배경 신호를 최소화하는 데 도움이됩니다.

프로토콜

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CyTOF의 모든 세포 샘플은 고정 per​​meabilized해야합니다. 이 이리듐 함유 DNA의 intercalator의 큰 항목을 가능하게하고, 또한 대량 cytometer에 주입하기 전에 즉시 MilliQ 물 세척 및 resuspension 단계 동안 세포 용해를 방지 할 수 있습니다.

1. 시작 - 최대 질량 Cytometer의

  1. CyTOF 소프트웨어 프로그램을 엽니 다. 악기 설정을 선택합니다. 카드 케이지 탭에서 오른쪽 하단 모서리로 이동하고 버​​튼을 "ON"히터를 클릭합니다. 200 ° C.에 도달하는 스프레이 챔버 맨틀에 대한 충분한 시간을 허용하도록 히터에 원하는 시간 전에 적어도 15 분을 돌려
  2. MilliQ 물로 가득 찬 신선한 주사기와 주사기 펌프에 흰색 규격-Ject 3 ML의 주사기를 교체합니다.
  3. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 작은 액체 소개 포트와 큰 가스​​ 도입 포트 모두를 통해 5% citranox 2 ~ 3 배를 끌어 주사기와 튜브를 사용하여 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 Backflush. MilliQ 물 t으로 backflushing 반복잔여 citranox를 제거 O.
  4. CyTOF의 전면 패널에있는 표시....

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결과

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위의 프로토콜을 따르면 네 가지를 달성해야합니다. 첫째, 대량 cytometer를위한 충분한 워밍업 시간을 허용하는 것은 최적의 신호와 최소한의 산화물 형성에 필요한 뜨거운, 안정적 플라즈마를 생성합니다. MilliQ 물과 DVS 워시 솔루션 (그림 9)와 대량 cytometer의 두 번째, 적절한 세척은 (그림 8) 샘플 수집하는 동안 배경을 감소하는 데 도움이, 금속 흡착의 수준 튜브와 기계의 다른 부분으로 줄일 도움이 될 것입니다. 또한 기계에 갇혀함으로써 샘플에서 샘플로 carryover를 최소화하기 수있는 세포를 제거하는 데 도움이됩니다. 산화 질량 M 16에서 배경을 최소화하면서 대량 cytometer (그림 5-7)의 셋째, 산화물 형성이 완전히 예방할 수 할 수는 없지만, 적절한 튜닝은 원하는 질량 M에 최적화 총 신호를 도움이 될 것입니다. 로 그림 10에서와 같이 부적절한 튜닝 (마젠타)는.......

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토론

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지난 몇 수십 년 동안 형광 유동 세포 계측법은 표면 표현의 측면과 기능 assays에서 모두 단일 세포를 분석 주력 방법이었습니다. 그러나, 형광 염료의 스펙트럼 중복의 문제가 동시에 마커의 수를 제한하고 있습니다. 12 개 이상의 동시 마커를 사용하여 실험이보고 된 반면, 필요한 보상의 양이 기술적으로 어려워집니다.

대신 fluorophores의, 대량 세포 계측법은 항체에 대한 라벨과 같은 금속에 킬레이트 사이트와 폴리머를 사용하여 DVS 과학에 의해 개척. 1-3 금속의 순도와 ICP-MS의 질량 해상도로 인해 효율적으로 더 "스펙트럼 중복이 없다"고 말했다. 사용 요소의 대부분은 생물학적으로 관련이없는 때문에, 원인 약간의 배경도 있습니다 "autofluoresence가." 이러한 사실은 하나의 실험에서 30 개 이상의 동시 마커의 사용을 허용합니다. 넓은 마구도 6,7 있습니다전형적인 형광 .......

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공개 사항

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인간 면역 감시 센터, 대량 세포 계측법을 포함한 assays의 비용을 복구 전적으로 사용자의 비용을 청구 스탠포드 대학에서 서비스 센터에서 저자는 일 모두.

감사의 글

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우리는 피드백을 박사 에반, 뉴웰 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 또한 멀티 란탄 족 함유 폴리스티렌 구슬의 샘플에 대한 DVS 과학 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 NIH 보조금이 U19 AI057229에서 자금에 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
CyTOF TM 대량 cytometer DVS 과학
솔루션을 씻으십시오 DVS 과학 201071 물에 0.05 % 불화 수소산 산
솔루션을 튜닝 DVS 과학 201072 0.5 ppm으로 라, CS, TB, TM, IR, 추적 질산
유럽​​ 연합 (EU) 함유 폴리스티렌 구슬 DVS 과학 201073 약 1,000,000 / ML에서 제공 구슬, 자연 풍부한 유럽 연합 (EU) 동위 원소를 포함
멀티 란탄 족 함유 (라 / 홍보 / TB / TM / 루) - 폴리스티렌 구슬 DVS 과학 아직 상업적으로에 사용할 수 등록 된 란탄 계열 원소의 자연 풍부한 동위 원소를 포함
질산 (집중) 피셔 과학 A467-500 Optima 추적 메탈 순수 ICP-MS 학년
폴리스티렌 내내 아래로 튜브 셀 스트레이너 캡-5mL로 BD 352235 주입하기 전에 세포 샘플을 필터링하는 데 사용
규격 - Ject tuberkulin 주사기-1mL 헨케 말대꾸 늑대 4010-200V0 실리콘 무료, 라텍스 무료
규격 - Ject의 주사기-3 ML 헨케 말대꾸 늑대 4010.000V0 실리콘 무료, 라텍스 무료
MilliQ 물 18 MΩ 순수한 물, 유리 또는 상업적 세제 (바륨 현재의 높은 수준으로 인해)으로 세척 한 플라스틱 병에 저장해서는 안됩니다.
Citranox 시그마 - 알드리치 Z273236 산성 세제
아르곤 가스 Praxair AR 5.0UH-T 99.999 % 초 고순도

참고문헌

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  1. Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
  2. Lou, X. Polymer....

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CyTOFICP MS

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