방법 논문

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

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DOI:

10.3791/4434

⸱

2013년 2월 20일

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

이 논문에서

요약

본 연구에서는 표준 배아 미세주입 및 실체현미경 장비를 활용한 제브라피쉬 치어의 새로운 미세강제투여(microgavage) 방법을 제시합니다. 우리는 미세강제투여가 다양한 물질을 제브라피쉬 치어의 장관 내로 정밀하게 정량 투여하는 데 유용한 안전하고 효율적인 기술임을 입증합니다.

초록

제브라피시는 장 발달1-5, 생리학6-11, 질병12-16 및 호스트-미생물 상호작용17-25을 연구하기 위한 강력한 모델 생물로 부상했습니다. 장 생물학 연구를 위한 실험적 접근 방식은 종종 선택된 물질을 장 내강으로 in vivo 도입하는 것을 필요로 합니다. 제브라피시 치어 모델의 경우, 이는 일반적으로 물고기를 선택된 물질의 용액에 침지시키거나 복벽을 통해 주입함으로써 수행됩니다. 침지법을 사용하면 장으로 전달되는 물질의 경로 또는 타이밍을 정확하게 모니터링하거나 제어하기 어렵습니다. 이러한 이유로 침지 노출은 장 이외의 조직에 의도하지 않은 독성 및 기타 영향을 미칠 수 있으며, 이는 장으로 전달될 수 있는 물질 양의 잠재적 범위를 제한합니다. 또한, 침지 노출 동안 섭취되는 물질의 양은 개별 치어마다 크게 다를 수 있습니다26. 복벽을 통한 직접 주입 시에는 이러한 문제가 발생하지 않지만, 적절한 주입이 어렵고 조직 손상을 유발하여 실험 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 본 연구에서는 제브라피시 치어를 위한 마이크로 가바지(microgavage, 미세 강제 급이) 방법을 소개합니다. 이 방법의 목적은 제브라피시 치어의 전장 내강에 조절된 타이밍으로 물질을 직접 전달할 수 있는 안전하고 효과적이며 일관된 방법을 제공하는 것입니다. 마이크로 가바지는 제브라피시 연구를 수행하는 대부분의 실험실에서 흔히 사용하는 표준 배아 미세 주입 및 실체 현미경 장비를 활용합니다. 물고기를 메틸셀룰로오스에 적절히 배치하면, 가바지는 분당 약 7-10마리의 속도로 빠르게 수행될 수 있으며, 가바지 후 생존율은 투여 물질에 따라 100%에 육박합니다. 또한 우리는 마이크로 가바지를 통해 침지 노출 시 물고기에게 치명적인 고농도의 물질을 장 내강에 적재할 수 있음을 보여줍니다. 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 장 내강에서 장 외 공간으로의 이동을 정량화하는 데 사용할 수 있는 형광 덱스트란 마이크로 가바지 분석법을 제시합니다. 이 테스트는 마이크로 가바지 절차의 적절한 수행 여부를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 다양한 실험 조건(예: 유전자 조작, 약물 처리 또는 환경 요인 노출) 하에서 장 상피 장벽의 무결성을 조사하는 새로운 제브라피시 분석법을 제공합니다. 나아가, 형광 미세구체를 가바지하고 이후의 이동을 모니터링함으로써 장 운동성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 마이크로 가바지는 살아있는 미생물, 분비된 미생물 인자/독소, 약물 및 생리학적 프로브와 같은 다양한 물질을 전달하는 데 적용될 수 있습니다. 이러한 기능을 통해 제브라피시 치어 마이크로 가바지 방법은 제브라피시 모델 시스템을 사용하는 광범위한 연구 분야를 발전시킬 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

마이크로 가바지(microgavage)용 치어를 얻기 위해 표준 제브라피쉬 사육 및 유지 관리에 관한 기발표된 프로토콜을 사용합니다27. 주로 자연 교배를 통해 물고기를 번식시키며, 14시간 명기/10시간 암기 주기로 유지합니다. 본 프로토콜은 수정 후 6-7일(dpf) 된 제브라피쉬 치어의 마이크로 가바지에 최적화되었습니다. 이러한 방법은 약간의 수정을 통해 더 어린 또는 더 성숙한 발달 단계에도 일반적으로 적용 가능할 것으로 예상됩니다. 별도의 언급이 없는 한, 6 dpf의 야생형 TL 제브라피쉬 계통을 사용하였으며 물고기에게 먹이를 공급하지 않았습니다. 모든 실험은 일반 제브라피쉬 양식 시설에서 얻은 시스템 워터(system water)에서 수행되었으나, 적절한 제브라피쉬 배지(e.g. 배아 배지 또는 무균 제브라피쉬 배지(GZM)28)를 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서 '제브라피쉬 배지'는 사용자가 선택한 배지를 의미합니다.

1. 메틸셀룰로오스 준비, 가바지 몰드 제작 및 마이크로가바지 바늘 제작

실험 전날 또는 실험 당일 이른 시간에 메틸셀룰로오스, 유충 고정용 아가로스 몰드 및 마이크로 가바지(microgavage) 바늘을 준비합니다.

  1. 3% 용액을 만들기 위해 멸균 탈이온수 또는 제브라피시 배지(용도에 따라 선택) 100 ml에 메틸셀룰로오스 3 g을 녹입니다. 병에 마그네틱 바를 넣고, 물을 끓기 직전까지 가열한 후 고온 설정의 교반기에 올립니다. 뭉치지 않도록 교반하면서 메틸셀룰로오스를 천천히 뿌려 넣습니다. 실온이 될 때까지 하루 동안 교반 속도와 교반기의 온도를 서서히 낮춥니다.
  2. 메틸셀룰로오스가 완전히 녹을 때까지 밤새도록 천천히 계속 교반합니다. 용액은 밀폐 용기에 담아 실온에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 제조사의 지침에 따라 플라스틱 캐스트(Adaptive Science Tools, TU-1)를 사용하여 10 cm 페트리 접시에 3% 아가로스 겔 몰드를 준비합니다. 건조를 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉하고 필요할 때까지 4 °C에서 보관합니다. 실험 전에 실온 또는 28 °C로 가온합니다. 아가로스 몰드는 일반적으로 여러 번 재사용할 수 있습니다.
  4. 붕규산 유리 모세관과 와이드 트러프 가열 필라멘트(FT330B)가 장착된 Flaming Brown 마이크로피펫 풀러를 사용하여 여러 개의 가바지 바늘을 제작합니다. 바늘 제작에 사용한 프로그램은 다음과 같습니다.
바늘 유형압력열인장력속도시간
배아50031510050200
강제경관급식50031512575200

필라멘트는 기기마다 다를 수 있으므로, 램프 시간(활성 가열 시간)을 기록하십시오. 본 프로그램의 램프 시간 범위는 8.57-8.79 ms입니다. 이 프로그램은 전통적인 미세주입 바늘보다 더 짧고 뭉툭한 바늘을 생성합니다(그림 1). 이러한 설정은 사용하는 미세피펫 풀러(micropipette puller)에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.

2. 마이크로가바지(Microgavage) 바늘의 절단, 충전 및 보정

참고*: 바늘 절단은 이 프로토콜에서 매우 중요한 단계입니다. 또한, 바늘 로딩 및 보정 방법은 사용하는 미세주입 장치의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 본 프로토콜은 Drummond II 미세주입기를 사용하여 최적화되었으나, 약간의 수정만 거치면 다른 미세주입 기기에도 적용 가능할 것으로 예상됩니다. 실험실마다 주입 장치와 바늘 인출기(needle puller)가 다르므로, 주입량을 측정하고 보정하는 것이 중요합니다(섹션 2.8 참조).

  1. 실체 현미경 하에서 바늘을 절단합니다. 2.5배율로 설정한 Leica S6E 실체 현미경을 사용합니다. 이 설정에서 100등분된 접안렌즈 눈금자(graticle)의 길이는 2 mm입니다.
  2. 바늘 끝을 눈금자 끝(100번 표시)에 맞추고, 미세 팁 시계 제작용 핀셋을 사용하여 끝에서 약 1 mm 지점(48-50번 표시)에서 바늘을 절단합니다 (그림 1A).
  3. 바늘의 직경은 약 27-30 μm여야 하며 끝이 뭉툭해야 합니다. 100배 배율로 바늘 끝을 검사하십시오. 바늘 끝이 날카롭거나 거칠면 가바지(gavage) 도중 손상될 확률이 높으므로 가능한 한 피해야 합니다.
  4. 또는 마이크로포지(microforge)를 사용할 수 있다면, 바늘 절단 지점을 더 정밀하게 제어하고 화염 연마(fire-polish)를 통해 날카로운 모서리를 제거할 수 있습니다 (그림 1B).
  5. 가바지 용액을 준비합니다. 대부분의 응용 분야에서는 마이크로인젝터의 정상 작동 여부와 전구(anterior bulb) 내 가바지 용액의 배치를 실체 현미경으로 관찰할 수 있도록, Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) (Sigma-Aldrich)에 0.5% phenol red 용액을 1:10으로 희석하여 첨가하여 용액을 준비합니다. Phenol red 외의 다른 로딩 염료는 평가되지 않았으나 사용 가능할 수 있습니다.
  6. 25G 5/8-바늘이 장착된 1 ml 주사기를 사용하여 미네랄 오일을 채워 가바지 바늘을 준비합니다. 이를 Nanoject II 마이크로인젝션 장치에 장착합니다.
  7. 플라스틱 10 cm 페트리 접시를 파라필름으로 감싸 평평하고 방수되는 표면을 만들고, 파라필름 위에 가바지 용액 약 2 μl를 소분합니다. 미네랄 오일 내에 기포가 생기지 않도록 주의하며 가바지 바늘을 수동으로 역충전(backfill)합니다.
  8. 마이크로인젝터의 기능을 테스트하고 분사 부피를 보정하려면, 3 cm 페트리 접시에 미네랄 오일을 채우고 액적의 크기가 일정해질 때까지 오일 속으로 주입합니다. 눈금자나 실체 현미경의 측정 기능을 사용하여 액적의 직경을 측정합니다. 액적의 부피를 계산합니다 (공식: V=4/3πr3). 바늘 간의 부피 일관성을 도표로 나타내었습니다 (그림 1C).
  9. 가바지를 시작하기 전, 바늘 끝을 깨끗한 제브라피쉬 배지에 반복적으로 담가 잔류 미네랄 오일을 제거합니다. 미네랄 오일은 밀도가 매우 높아 바늘 끝에서 씻어내지 않으면 상피 조직에 손상을 줄 수 있습니다.

3. 제브라피쉬 치어의 마취, 고정 및 경구 투여

  1. 실험 전 아가로스 몰드를 상온 또는 28 °C에서 가온합니다.
  2. 3% 메틸셀룰로오스로 3개의 홈을 덮어 강제 경구 투여용 아가로스 몰드를 준비합니다. 홈을 덮고 물고기를 고정하기에 충분한 양의 메틸셀룰로오스를 사용하되, 너무 적어서 빠르게 마르지 않도록 합니다.
  3. 깨끗한 6-well 플레이트에 각 실험군별 제브라피시 치어를 분리하여 넣으며, 각 웰에는 3.5-4.0 ml의 제브라피시 배지를 포함합니다.
  4. 적절한 제브라피시 배지에 3x 트리카인 용액(0.05% w/v)을 준비합니다. 치어가 들어 있는 웰에 3x 트리카인을 동일한 부피로 혼합하여 최종 농도가 1.5x (0.025%)가 되게 한 뒤, 부드럽게 소용돌이치듯 섞어 웰 하나씩 물고기를 마취시킵니다.
  5. 제브라피시의 움직임이 멈추는 즉시, 넓은 구경의 유리 파스퇴르 피펫과 피펫 펌프를 사용하여 웰에서 꺼냅니다. 그 후, 머리는 홈의 45° 각도에 두고 꼬리는 홈의 90° 각도 방향으로 놓이도록 메틸셀룰로오스 위에 한 마리씩 배치합니다. 뭉툭한 해부 프로브로 메틸셀룰로오스 속으로 부드럽게 눌러 위치를 고정합니다.
  6. 바늘이 아가로스 몰드의 45° 각도와 거의 평행하도록 얕은 각도로 기울어지게 Nanoject II 미세주입 장치를 조정합니다. 물고기를 배치한 후 조정 횟수를 줄이기 위해 바늘의 확장 범위가 몰드 웰의 바닥 너머까지 도달할 수 있도록 충분히 설정하십시오.
  7. 미세주입 장치를 저속 주입 설정(23 nl/sec)에서 최대 4.6 nl가 방출되도록 설정합니다. 이 설정에서 전달된 부피는 장의 앞쪽 팽대부(anterior bulb)를 겨우 채우는 정도여야 하며, 식도나 배설강으로 새어 나오지 않아야 합니다. 실험 목적에 따라 더 적은 부피를 사용할 수 있습니다.
  8. 한 손으로는 고정된 치어가 담긴 플레이트를 미세하게 조정하는 동시에, 다른 손으로는 미세주입 장치의 매니퓰레이터를 조작합니다.
  9. 마취된 물고기의 입으로 강제 경구 투여 바늘을 부드럽게 조작하여 식도를 통과시킨 뒤, 식도 괄약근을 살짝 눌러 강제 경구 투여 바늘의 끝이 장의 앞쪽 팽대부 바로 안쪽에 진입하게 합니다(Figure 2, step 1-2, a&b).
  10. 앞쪽 팽대부 내부에 진입하면, 풋 페달이나 주입 버튼을 부드럽게 눌러 물질을 투여합니다. 식도에 상당한 양의 물질이 방출되지 않도록 주의하며 바늘을 빠르고 부드럽게 회수합니다(Figure 2, step 3-4).
  11. 강제 경구 투여 후, 넓은 구경의 유리 파스퇴르 피펫과 피펫 펌프를 사용하여 제브라피시 치어를 신선한 배지로 부드럽게 옮깁니다. 피펫의 굴곡진 부분 위로 약 1인치까지 물을 채운 뒤, 치어의 머리 옆 메틸셀룰로오스에 작은 물 주머니를 만들어 분리하고, 머리를 피펫 입구로 부드럽게 들어 올려 치어를 메틸셀룰로오스에서 뽑아냅니다. 물고기와 모든 물을 신선한 배지가 담긴 접시에 부드럽게 배출합니다.
  12. 신선한 배지에서 피펫팅을 부드럽게 반복하거나 배지를 여러 번 뿌려 메틸셀룰로오스를 제거하고 치어를 마취 상태에서 깨웁니다. 이후 영상 촬영 및 분석이 필요할 때까지 치어를 페트리 접시나 6-well 플레이트로 옮깁니다.

4. 존데 투여 안전성 및 장벽 무결성 검사를 위한 덱스트란 분석

마이크로가바지(Microgavage)는 다양한 물질을 장내로 전달하는 데 사용될 수 있습니다. 그 예로, 장 상피의 장벽 무결성을 분석하기 위해 Texas Red가 결합된 10 kD dextran을 가바지하는 프로토콜을 아래에 제공합니다. 세포 간 투과성에는 전하와 용질의 크기에 따라 선택성이 다른 적어도 두 가지 잠재적 경로가 존재하며, 이를 "pore" 또는 "leak" 경로라고 합니다29. 이 dextran은 세포 간 pore 경로를 통해 장 상피를 가로질러 흡수되기에는 크기가 너무 크므로(크기 제한 ~4Å, 10kD dextran= ~23Å)9,30-32, 장 장벽 무결성이 손상되지 않았다면 루멘 내에 유지되어야 합니다. 10 kD dextran이 세포 간 leak 경로를 통해 운반될 수 있지만, 이 경로는 용량이 더 낮고 역학이 더 느리므로29,33, 본 분석의 시간 범위 내에서는 발생할 가능성이 낮습니다. 장벽 무결성을 파괴하는 '양성 대조군' 처리는 상피 밀착 연접을 파괴하는 EDTA를 포함함으로써 수행됩니다34,35. 이 dextran 가바지 분석은 가바지 절차가 의도치 않은 조직 손상 없이 안전하게 수행되고 있음을 입증하는 품질 관리 테스트로 사용될 수 있습니다. 또한, 이 분석은 유전자형이나 처리에 따른 장 장벽 무결성을 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.

  1. 다음의 가바지(gavage) 용액을 준비한다: 1% dextran/1x PBS/0.05% phenol red 및 1% dextran/20 mM EDTA/1x PBS/0.05% phenol red(양성 대조군). 동결-해동 반복 횟수를 줄이기 위해 ddH2O에 녹인 5% dextran 스톡 용액은 50 μl씩 분주하여 -20 °C에 보관한다. 또한, 1x PBS/0.05% phenol red로 구성된 모의 가바지(mock gavage) 용액을 준비한다.
    양성 대조군 (EDTA)EDTA 미포함
 스톡 용액최종희석 배수10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
덱스트란5%1%522
인산완충생리식염수10배1배(1x)1011
페놀 레드0.50%0.05%1011
   소계:54
   이중 증류수2제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 원문 텍스트를 입력해 주세요.56
   합계:1010
  1. 섹션 3의 프로토콜을 사용하여 각 실험 조건별로 10-20마리의 제브라피쉬 치어 그룹에 경관 급여(gavage)를 수행합니다. 가능하면 이 과정을 중복 또는 3회 반복 그룹에 대해 실시하십시오.
  2. 경관 급여 후, 치어를 마취 상태에서 회복시키고 신선한 배지에서 자유롭게 헤엄칠 수 있도록 합니다.
  3. 경관 급여 18-20분 후, 단계 3.3과 같이 치어를 재마취합니다. 3% 아가로스 블록 위에 3% 메틸셀룰로오스를 사용하여 치어를 배치합니다(이는 이미징 시 배경 눈부심을 줄여줍니다).
  4. 형광 실체 현미경(예, Leica M205C)과 Texas Red 필터 세트를 사용하여, 주둥이부터 배설강 끝 바로 뒷부분까지 치어가 보이는 배율로 이미지를 촬영합니다.
  5. 나중에 정량화하고 비교할 수 있도록 모든 이미지를 동일한 노출 설정으로 획득합니다. 덱스트란을 주입한 모든 치어의 장관 루멘에서는 강한 형광이 나타나지만, 장벽 기능은 장외 조직(즉, 몸통 및 혈관)에 나타나는 덱스트란의 수준으로 평가합니다(그림 5). 루멘 형광이 과다 노출되더라도 몸통의 형광을 시각화할 수 있는 설정으로 노출을 조정하십시오.
  6. 각 그룹이 경관 급여 후 회복에 소요하는 시간과 경관 급여 후 이미징이 수행되는 시간이 거의 동일하도록 경관 급여 시간을 조절합니다. 이 실험의 경우, 한 사람이 한 그룹을 완료하는 데 약 1시간이 소요됩니다. 물고기는 경관 급여 18-20분 후에 마취하며, 이미징은 마리당 약 1-2분이 소요됩니다.
  7. ImageJ와 같은 이미지 분석 프로그램을 사용하여 장 바로 위의 몸통 영역에서 상대적 평균 형광 강도를 정량화합니다. 물고기 외부의 이미지 영역에서 측정된 배경값을 빼서 이 값들을 정규화합니다.
  8. GraphPad Prism 또는 유사한 통계 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석 데이터를 그래프로 나타내고 분석합니다.

5. 장 운동성 테스트를 위한 형광 미세구슬 분석법

강제 경구 투여(Gavage)는 장으로 전달되는 물질의 시점과 양을 정밀하게 조절할 수 있어, 장 운동성 연구를 위한 이상적인 대체 방법이 됩니다. 제브라피쉬 치어의 장 운동성을 측정하기 위해 이전에 발표된 기술로는 현미경을 통한 장 수축 및 파동의 직접 관찰1,21,36이나, 황록색 형광 폴리스티렌 미세구(microspheres)를 혼합한 먹이를 치어에게 급여하는 방법26 등이 있습니다. 일부 연구에서는 식용 색소가 포함된 배지에 치어를 침전시키거나37, 시공간 매핑(spatiotemporal mapping)이라 불리는 특수 비디오 분석 기술을 사용하여38,39 장 운동성 패턴의 정량화를 개선하였습니다. 본 논문에서는 형광 미세구를 장의 전구(anterior bulb)에 강제 경구 투여하는 것이 가능하며, 미세구의 이동 경로를 추적하여 장 운동성을 평가할 수 있음을 보여주는 개념 증명 연구를 제공합니다(Figure 6). 이 방법과 Field 및 동료들의 접근 방식26의 주요 차이점은 비즈를 단독으로 주입하며, 강제 경구 투여용 바늘의 직경 제한으로 인해 먹이에 혼합하여 사용할 수 없다는 점입니다.

  1. 제브라피쉬 치어를 10 cm 플레이트 내 35 ml 배지에서 배양하며 7 dpf에 실험을 수행할 때까지 유지한다. 5 dpf부터 매일 아침 한 번씩 약 0.6 mg의 분말 먹이(이전 설명된 치어 사료40; 멸균된 1 mm 접종 루프를 사용하여 투여)를 공급하기 시작한다.
  2. Fluoresbrite YG 2.0 μm 폴리스티렌 미세구체(~2.5% 수성 현탁액) 병을 가볍게 흔들어 현탁액을 혼합한다. 피펫팅으로 특정 부피를 측정할 수 있도록 병에서 파라필름 위에 한 방울을 덜어낸다.
  3. 에펜도르프 튜브에 담긴 비즈를 벤치탑 원심분리기에서 저속으로 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 원래 부피만큼 1x PBS로 교체한다. 이 과정을 반복하여 미세구체를 2회 세척한다.
  4. 0.25% 미세구체(스톡 현탁액을 1:10으로 희석)/1x PBS/0.05% 페놀 레드를 포함하는 존데 투여 현탁액을 준비한다. 치어당 투여되는 4.6 nl의 존데 부피에는 약 2.6x103개의 미세구체가 포함되어 있다.
  5. 섹션 3의 프로토콜을 사용하여 원하는 수의 치어에게 존데 투여를 실시한다. 미세구체는 어느 정도 부력이 있으므로, 현탁액의 일관성을 최대화하기 위해 존데 투여를 가능한 한 신속하게 수행해야 한다.
  6. 본 실험에서는 개체별 이동을 추적하기 위해 15마리의 치어에게 존데 투여를 실시한 후, 마취에서 회복시킨 다음 12-웰 플레이트의 개별 웰에서 유지하였다. 그러나 더 많은 그룹에 존데 투여를 실시하고 개별적이 아닌 집단으로서의 이동을 평가할 수도 있다. 표준 절차에 대해서는 Field et al.을 참조한다26.
  7. 형광 입체현미경을 사용하여 서로 다른 시간대에 살아있는 치어 내 형광 미세구체의 가장 기측(또는 전방) 위치를 점수화하여 장 운동성을 평가한다. 치어를 1x (0.017%) 트리카인으로 짧게 마취하고, 미세구체 위치 구역을 점수화하거나 나중에 점수화하기 위해 이미지를 캡처한다.
  8. 시간 경과에 따라 특정 장 영역에 미세구체가 있는 전체 치어의 백분율을 그래프로 나타내고 비교한다.

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결과

강제 경구 투여(gavage)가 적절하게 수행되면, 투여된 물질은 식도에 잔류물이 거의 또는 전혀 없이 전장(anterior intestine) 내에 완전히 포함되어야 합니다(그림 3). 투여량은 전구(anterior bulb) 내에 수용 가능하며 배설강이나 식도로 누출되지 않는 부피로 선택해야 합니다. 투여 물질의 부피나 투여 압력이 너무 높으면, 강제 경구 투여의 물리적인 힘으로 인해 상피 세포가 손상되거나 누출이 발생할 수 있습니다. 또한, 이는 루멘 환경의 다른 성분(예: 담즙 또는 점액)을 밀어내거나 변화시켜 국소 생화학적 환경을 바꾸고 잠재적으로 결과에 혼선을 줄 수 있습니다. 일반적으로 물질 투여 후 바늘을 빠르게 회수하면 식도 괄약근이 닫혀 식도로의 상당한 누출을 방지할 수 있습니다.

이 존대법(gavage) 방법은 침지법(immersion method)에 비해 제브라피쉬 치어 조직으로의 물질 노출 시점과 경로를 더 정...

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토론

본 연구에서는 마이크로가바지(microgavage)를 통해 제브라피시 치어의 장으로 물질을 직접 전달하는 새로운 프로토콜을 설명합니다. 전체 과정에서 유의해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 처치와 무관한 사망을 방지하기 위해 가바지 실험 전 제브라피시 치어의 건강 상태가 양호해야 합니다. 또 다른 중요한 요소는 가바지 바늘의 품질입니다. 프로토콜에서 가장 어려운 부분 중 하나는 날카롭고 거친 가장자리를 만들지 않고 적절한 위치에서 바늘을 절단하는 것입니다. 마이크로피펫 마이크로포지(micropipette microforge)를 사용하면 더 일관되게 바늘을 절단할 수 있으며, 바늘 끝을 화염 연마(fire-polish)하여 날카로운 가장자리를 없앨 수 있습니다. 필수적인 것은 아니지만, 마이크로포지로 제작된 바늘은 시술 중 치어가 손상되는 빈도를 줄여줍니다. 또한, 아가로스 몰드 없이 3% 메틸셀룰로스(methylcellulose)에 고정하여 마이크로가바지를 수행할 수 있습니다. 하지만 몰드를 사용하면 물고기를 적절...

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공개 사항

선언된 이해상충 없음.

감사의 글

콘텐츠에 대한 유용한 제안을 해주신 Rawls 연구실 구성원분들과, 밀착 연접의 크기 투과성 및 파괴 방법에 대해 가치 있는 논의를 나누어 주신 Alan Fanning 박사님께 감사드립니다. 또한, 공초점 현미경 지원을 해주신 Michael Hooker Microscopy Facility의 Michael Chua 박사님과 Neal Kramarcy 박사님께 감사드립니다. 본 연구는 국립보건원(NIH) 보조금 T32 DK007737-15(J.L.C. 연수생), F32 DK094592(J.L.C. 수혜), R01 DK081426(J.F.R. 수혜)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Finquel (Tricaine methanesulfonate)Argent Chemical LaboratoriesMS-222유충 마취
페놀 레드 용액Sigma-AldrichP0290-100 mlDPBS 내 0.5%, 세포 배양 테스트 완료
미네랄 오일, 라이트, 화이트 (고순도)AmrescoJ217-500 ml바늘 역충전 및 부피 테스트용
TxRed-Dextran, 10,000 MW, 라이신 고정 가능Invitrogen/ Molecular ProbesD-18631x PBS/페놀 레드 내 1% 현탁액
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653물에 용해된 5 mM 스탁 용액
메틸셀룰로오스MP Biochemicals0215549590
붕규산 유리 모세관Drummond Scientific3-000-203-G/X외경 1.14 mm, 내경 0.53 mm, 길이 3.5 in
몰드 제작용 플라스틱 틀적응형 과학 도구TU-1
Nanoject II 미세주입 장치Drummond Scientific3-000-204
화염식 Brown 마이크로피펫 풀러, 3.0 mm 넓이 홈 필라멘트Sutter Instrument Co.P-97, FT330B바늘 제작
Student Dumont #5 핀셋Fine Science Tools91150-200.1 x 0.06 mm, 니들 클리핑
접안마이크로미터, 5 mm - 100등분Leica10394771바늘 절단
마이크로포지(Microforge)NarishigeMF-900바늘 절단 및 화염 연마
투베르쿨린 SlipTip 시린지 바늘Becton Dickinson3096261 ml, 25G 5/8-바늘
Fluoresbrite YG 미세구체 (2.0 μm)Polysciences, Inc.18338장 운동성 분석
해부 현미경LeicaS6E강제 투여법 (Gavage procedure)
형광 실체 현미경LeicaM205C덱스트란 장벽 분석법
공초점 현미경ZeissLSM510혈중 덱스트란의 영상화

참고문헌

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

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