설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.
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이 논문에서
요약
초록
5 methylcytosine (5-MC)는 인간 게놈 DNA의 총 cytosines의 ~ 2-8%를 구성하고 유전자 발현, 게놈 무결성 유지, 부모의 각인, X-염색체 불 활성화, 규제 등의 생물학적 기능의 광범위한 영향을 개발, 노화, 암 1. 최근 산화 5 MC, 5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)의 존재는 배아 줄기 (ES) 세포와 neuronal 세포 2-4, 특히 포유류의 세포에서 발견되었습니다. 5 HMC는 TET 가족 철 (II) / α-ketoglutarate에 따라 달라 dioxygenases 2, 3 5 - MC 촉매의 산화에 의해 생성됩니다. 5 HMC는 배아 줄기 (MES) 세포, 정상 조혈 및 malignancies, 그리고 접합자 개발이 5-10의 유지에 참여 제안합니다. 더 나은 5 HMC의 기능을 이해하기 위해서는 안정적이고 간단한 시퀀싱 시스템이 필수적입니다. 전통 bisulfite 배열은 5 - MC 11 일부터 5 HMC을 구별 할 수 없습니다 12 포도당 잔기를 추가 박테리오파지 효소 활용, 라벨 및 5-HMC를 캡처 할 수있는 매우 효율적이고 선택적 화학 접근 방식을 개발했습니다.
여기 5 HMC의 선택적 화학 라벨에 대한 간단한 두 단계 절차를 설명합니다. 첫 번째 라벨 단계에서, 게놈 DNA의 5 HMC는에서 5 HMC에 6 azide 포도당를 전송하는 방식으로, β-GT, T4 박테리오파지에서 glucosyltransferase로 6 azide-포도당 촉매으로 표시됩니다 수정 cofactor, UDP-6-N3-Glc (6 N3UDPG). 두 번째 단계, biotinylation에서 이황화 비오틴의 링커는 클릭 화학으로 azide 그룹에 연결되어 있습니다. 두 단계는 게놈 지역에서 5 HMC의 풍부한 관계없이 라벨 매우 낮은 배경을 제공 완료로 이어지는, 매우 구체적이고 효율적이다. 5 HMC의 후 biotinylation, 5 HMC 함유 DNA 조각을 한 후 선택적으로 캡처되어밀도 독립적 인 방식으로 streptavidin 비즈를 사용합니다. 그 결과 5 HMC 강화 DNA 조각은 차세대 시퀀싱 등의 다운 스트림 분석을 위해 사용될 수있다.
우리의 선택 레이블 및 캡처 프로토콜은 다양한 / 변수 5 HMC의 abundances과 게놈 DNA의 소스에 해당 높은 감도를, 수여. 이 프로토콜의 주요 목적은 자사의 다운 스트림 응용 프로그램 (예., 차세대 시퀀싱은 게놈의 5 HMC 배포를지도)이지만, 단일 분자입니다 실시간 SMRT (DNA) 시퀀싱과 호환됩니다 5 HMC의 단일 기본 해상도 시퀀싱을 제공 할 수.
프로토콜
1. 게놈 DNA 조각
원하는 크기 범위로 sonication을 사용하여 조각 게놈의 DNA는 게놈 전체 시퀀싱 플랫폼에 가장 적합합니다. (우리는 보통 ~ 300 BP에 sonicate.) 1% 아가로 오스 겔 (그림 1)에 조각 게놈의 DNA의 크기 분포를 확인합니다.
2. DNA 준비
게놈 DNA의 5 HMC의 풍부한에 따라 시작 DNA 금액을 확인합니다. 5 HMC 수준이 다른 조직 유형에 크게 다르므로, 시작 DNA의 금액은 샘플 5 HMC 수준에 따라 달라집니다. 예제 표 1을 참조하십시오.
3. β-GT 촉매 반응 (포도당 전송 반응)
- 1 시간에 37 ° C 물 목욕의 표 2와 배양에 명시된 바와 같이 혼합물을 pipetting하여 섞는다.
- 부화 후, DNA의 10 μg을 당 사용 QIAquick 염기 제거 키트와 반응을 정리열. 열 30 μl 물 Elute과 조화를 이루고 있습니다.
4. Bio....
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토론
5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)는 특정 포유류의 세포 유형에서 상당한 양의 최근 확인 epigenetic 수정 존재입니다. 여기에 제시된 방법은 5 HMC의 게놈 전체의 분포를 결정하기위한 것입니다. 우리는 5 HMC의 수산기 그룹에 azide 그룹을 포함하는 엔지니어링 포도당 잔기를 전송하는 β-glucosyltransferase T4 박테리오파지를 사용합니다. azide 그룹은 화학적으로 포유류의 genomes에 5 HMC 함유 DNA 조각의 감지, 연관성 강화, 그리고 배열 비오틴을 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 hMeDIP은 간단하지만, 그 고밀도 5 HMC 지역에 대한 강한 편견을 가지고 있으며 일반적으로 독립 풀에서 일관 결과를 제공, 5 HMC 항체 기반 hydroxymethylated DNA의 immunoprecipitation (hMeDIP-Seq) 13-15 이상의 장점이 있습니다 다운. 우리의 방법은 편견을 소개 할 것입니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (CH와 NS051630/MH076090/MH078972에 PJ에 GM071440)에 의해 부분적으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 | 회사 | # 카탈로그를 | 논평 |
| 시약 | |||
| 5M 나트륨 염화물 (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma베이스 (트리스) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15,630 | |
| 염화 마그네슘 (MgCl 2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| 디메틸 sulfoxide (DMSO) | 시그마 | D8418 | |
| 십대 초반 20 | 피셔 BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-SS-PEG3 - 비오틴 공액 | 화학 도구를 클릭합니다 | A112P3 | |
| 1,4 - Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick 염기 제거 키트 | Qiagen | 28,304 | |
| 마이크로 바이오 스핀 6 열 | 바이오 RAD | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen PCR MinElute 정화 키트 | Qiagen | 28,004 | |
| UltraPure 아가로 오스 | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N 3 포도당 | 활성 Motif로 | 55,013 | |
| 효소 | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | 뉴 잉글랜드 Biolab | M0357 | |
| 장비 | |||
| Sonication 장치 | Covaris | ||
| 데스크탑 원심 분리기 | |||
| 열탕 목욕 | 피셔 과학 | ||
| 젤 실행 장치 | 바이오 RAD | ||
| NanoDrop1000 | 열 과학 | ||
| Labquake 튜브 쉐이커 | Barnstead | ||
| Labquake 튜브 쉐이커 | Thermolyne | ||
| 자기 분리 스탠드 | Promega | Z5342 | |
| 큐빗 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| 시약 설정 10 X β-GT 반응 버퍼 (500 MM의 HEPES 산도 7.9, 250 MM MgCl 2) 2 X 구속력과 (10 MM 트리스 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 M NaCl, 0.02 % 십대 초반 20) (B & W) 버퍼를 세척 . |
참고문헌
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell s....
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재인쇄 및 허가
