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방법 논문

장기 성인 마우스 SSC 라인의 유도를위한 문화 Spermatogonial 줄기 및 전구 세포의 일련 농축 (SSCs)

13.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50017

⸱

2013년 2월 25일

 , 
1Department of Surgery, Weill Cornell Medical College

이 논문에서

요약

성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 - 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.

초록

Spermatogonial 줄기와 testis의 전구 세포는 (SSCs) 성인 포유류의 줄기 세포의 고전적인 예를 나타냅니다과 동물의 거의 평생 불임을 보존 할 수 있습니다. 생체에 자기 갱신과 차별화에 적용되는 정확한 메커니즘은 연구에 도전하고 있지만, 다양한 시스템은 전문 문화 미디어 및 1-3 피더 세포의 조합을 사용하여 체외에서 손쥐 SSCs를 전파하는 이전에 개발되었습니다.

SSCs의 생물에 체외 forays의 대부분은 성인 세포 라인에게 4 취득의 어려움으로 인해 neonates에서 세포 라인을 도출했습니다. 그러나, testis는 대부분의 마우스 변종에 세 ~ 5 주가 지나야까지 성숙을 계속하고 있습니다. 초 후 산후 시대에는 극적인 변화가 testis의 아키텍처와 체세포와 많은 줄기 세포 관련의 표현 수준의 변경 등의 spermatogenic 세포, 모두의 생물학에서 발생유전자. 따라서 neonatally - 파생 SSC 라인이 완전히 성인 testis가 정상 상태에 도달 한 후 계속 성인 SSCs의 생물학을 요점을 되풀이하지 않을 수 있습니다.

여러 가지 요인이 역사적으로 성인 SSC 라인의 생산을 방해하고 있습니다. 첫째, 기능 줄기 세포의 비율은 고유 또는 외부 요인으로 인해 5,6하거나, 성인기 동안 감소 할 수 있습니다. 또한, 다른 성인의 줄기 세포와 마찬가지로, 그것은 immunoselection 또는 다른 정렬 전략 7의 조합을 사용하지 않고 전체 성인 고환 세포에서 충분히 SSCs을 풍요롭게하기 어려운되었습니다. 일반적으로 고용 전략은 다른 세포 유형 8 줄기 세포의 높은 비율로 인해 공여 세포의 원천으로 cryptorchid 마우스의 사용을 포함합니다. 초기 문화의 체세포 세포의 제거는 SSC의 생존에 필수적인 줄기 세포 틈새와의 상호 작용을 방해하는 가설을 바탕으로, 우리는 이전에 성인 리터를 추출하는 방법을 개발immunoselection 또는 cryptorchid 기증자를 필요로하지만, 오히려 문화에 SSCs의 일련 농축을 채용하지 않는 아이 네스는 SESC 2,3로 이하라고.

아래에서 설명하는 방법은 고환 stromal 세포 라인 (JK1) 3으로 구성 피더에 대한 세포의 도금에 이어 성인 기증자 정액을 운반하는 tubules를 dissociating하여 성인 SSC 라인을 파생하는 간단한 절차를 수반. 시리얼을 통해 비 배아 세포를 오염, 강하게 자기편, passaging 것은 SSCs의 수반하는 농축과 문화의 고갈됩니다. 이러한 방식으로 생산 문화는 장기적으로 자기 갱신 능력에 따라 SSCs를 포함하는 차별화의 다른 단계에서 spermatogonia의 혼합물을 포함합니다. SESC 방법의 요점은 그것이 근본적으로 다른 microenvironment의 체외에서 장기간 자기 갱신에 생체의 자기 갱신의 어려운 전환을 할 SSCs 수 있다는 것입니다, 오염 무료, 장기 SSC 라인을 생산체세포의 세포, 그리고이를 SSCs의 후속 실험 조작을 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 피더 셀의 준비

아래에 설명 된 모든 시약은 (표 1 및 2 참조) 살균 방식으로 준비해야합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 고환 체세포 세포의 변화를 파생하고 다른 3 설명 된 피더로 JK1 세포주 (셀 Biolabs, 주식회사, 카탈로그 # CBA-315)를 사용하고 있습니다. 모든 동물 절차 기관 지침 및 규정에 따라 수행되어야한다고도합니다.

  1. JK1 세포는 문화에 유지 통로 39 성공적으로 피더를 사용할 수 있습니다. 필터 소독 피더 성장 매체 10 ML과 100mm 세포 배양 접시 (BD 팔콘, 카탈로그 # 353003)의 문화 JK1 세포를 (DMEM와 함께 보충 10% 태아 소 혈청 [FBS], 2 MM L-글루타민과 항생제). 문화가 95 %의 합류에 도달하면, 세포에게 1시 6분 -1:10 비율을 분할.
  2. 합류 JK1 피더 셀 모노에서 매체를 제거합니다층.
  3. 칼슘, 마그네슘없이 PBS로 한 번 셀 레이어를 씻으십시오.
  4. 미리 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1X (0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 코닝 Cellgro, 카탈로그 # 25-051 - CI)를 추가하고 37 번 ° C 5-10 분에 품다.
  5. 피더 성장 매체의 동일한 볼륨과 트립신을 비활성화. 세포를 수집하고 5 분 300 XG에 원심 분리기. 피더 성장 매체에 세포를 다시 일시 중지합니다.
  6. 잘 덮어 실온에서 5 분 후 제거하기에 충분한 0.4 % 젤라틴 용액을 추가하여 사전 코트는 멀티도 세포 배양 접시.
  7. 판 ~ 젤라틴 - 코팅 세포 배양 판에 mm 2 당 250 세포 (예를 들어 48도 또는 6 - 잘 형식). 16-24 시간에 37 ° C에서 문화를 품다.
  8. 우물에서 문화 매체를 제거합니다. 주의 : 세포 성장을 비활성화로 DMEM에 희석 10 μg / ML에서 미토 마이신-C의 새로운 솔루션을 추가하려면 각도 (예를 들어 200 μl / 잘 48 잘 접시). 미토 마이신-C는 독성이 있습니다. 처리 및 관리와 함께 폐기하십시오. 에 품다37 ° C 4 시간에.
  9. 세포에서 미토 마이신-C 솔루션을 제거합니다. 도금의 줄기 세포 이전에 DMEM으로 3 번 씻으십시오.
  10. 피더 세포 우물에서 DMEM을 제거하고 충분한 줄기 세포 매체 (100 μl / 잘 48 잘 접시의, 표 3 참조)을 추가 passaging 동안 피더의 탈수를 방지하기 위해합니다. 피더를 포함하는 우물의 지정된 크기를 사용하여 섹션 3.1 또는 3.4에서 아래에 설명 된대로, 당일 SSCs를 추가합니다.

2. 마우스 Testis 조직의 분리는 기증자 배아 세포를 구하는

  1. 수확 성인 마우스 살균 방식으로 고환 일시적으로 덮인 페트리 접시 (모든 액체없이 추가)에 고환을 저장합니다. dessication을 방지하고 세포 생존 능력을 유지하기 위해 음식은 얼음에 즉시 배치해야합니다.
  2. ¾ 거리 thr - 무균 고급 집게 및 세포 배양 동네에서 고급 가위를 사용하여 완전히 testis (즉, 잘라 내기 ~ ½를 끊어 버렸네없이 혈관의 albuginea의 가로 절개를ough)과 접시의 코너에 정액을 운반하는 tubules의를 쥐어 짜 집게를 사용하여, 폐기 혈관 및 첨부 조직. 이를 통해 자사의 무결성을 유지하고 증발을 방지 조직은 차가운 유지하기를 통해 얼음 판세요.
  3. 얼음 판을 유지하면서 빠르게, 봄날의 가위 testis 당 최소 3 분으로 tubules를 이기다.
  4. 50 ML 원뿔 튜브에 가느 다란 관 조각을 수집하고 알부민 차가운 PBS / 1퍼센트 소 혈청의 ~ 40 ML에 씻는다.
  5. 마리의 정자 수야과의 잔해로부터 가느 다란 관 조각을 분리 할 수​​ 10 분 60 XG에 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
  6. 15 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 분리 버퍼의 testis 당 3 ML (DMEM, 0.05 % 트립신, 0.03 %의 Collagenase 유형 I, 80 U / DNAse I의 ML와 0.5 % 소 혈청 알부민에 펠렛을 resuspend, 표를 참조하십시오 해리 버퍼의보다 구체적인 내용은 2).
  7. 을 최대화하기 위해 15 분에 37 ° C에서 150 rpm에서에 쉐이커 세트의 랙에 수평으로 원뿔 튜브를 삽입합니다gitation.
  8. undissociated 덩어리에서 분리 한 세포를 10 분 60 XG에 스핀 다운.
  9. 다음 단계까지 펠릿이 포함 된 청크를 저장합니다. 단계 2.8에서 표면에 뜨는 수집하고 해리 버퍼를 중화 할 수있는 3 ML DMEM/10 % 태아 소 혈청을 추가합니다. 일시적으로 얼음에 튜브를 삽입합니다.
  10. 단계 2.9에서 저장 한 환약을 2.6-2.7 단계를 단계 2.8 이후에 남은 재 다이제스트 덩어리에 반복합니다.
  11. 해리 버퍼를 무력화 DMEM/10 % FBS의 동일한 볼륨을 추가합니다.
  12. 단계 2.9에서 저장된 세포 현탁액과 단계 2.11에서 재결합 정지. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
  13. 고환의 쌍 당 16 ML의 볼륨에서 줄기 세포 매체에 Resuspend 펠릿 (표 3 참조).

3. 고환 세포 현탁액의 도금

  1. 세포 현탁액의 플레이트 2 ML 당 잘에서 6 잘 플레이트 포함 피더 세포 37 &에서 세포 배양 인큐베이터에서 미토 마이신-C, 장소와 mitotically-inactivated℃ 일, C 5 % CO 2.
  2. 48 시간, 대기음 매체 후, 2 ML 신선한 매체를 추가하고 보육 돌아갑니다.
  3. 48 시간 후, 각도에 0.5 ML 신선한 줄기 세포 매체를 추가하고 보육 돌아갑니다.
  4. 48 시간 후, 이후 세포에게 일주일에 세 번 이후로 큰 신중한 식민지 (> 50 세포) (7-21일 이내) 나타날 때까지 다음 먹이를. 매주 먹이 첫 번째와 두 번째 (예 : 월요일, 수요일)에 대한 매체의 ~ 50 %를 제거하고 신선한 매체의 볼륨에 의해 다시 50 %를 추가 할 수 있습니다. 셋째 수유를 들어 (예 : 금요일), 모든 매체를 대기음 2 ML 신선한 매체로 대체합니다. 이 접근 방식은 전체 매체 변화의 소지를 없애기는 문화 매체 9에 숨겨진 paracrine 신호의 농도의 변동을 최소화하는 근거에 기반을두고 있습니다.

4. 제 1 통로에 대한 식민지 따기

  1. passaged 할 우물 포함 식민지에서 미디어를 제거하고 신선한 줄기 세포 매체를 추가 할 수 있습니다.
  2. 가 10 배 목표를 사용하여 식민지를 식별합니다. 현미경 약간 드 중심으로 잘의 가장자리에서 SSC의 식민지는 세포부터가 어렵거나 개별 셀 테두리를 판별하는 것은 불가능입니다 많은 11-12 μm의 직경 세포로 구성되어 균일 한 밝은 clumps로 나타납니다 (그림 1A) 융합 나타납니다. 비 SSC 식민지가 뚜렷한 경계 (그림 1A, 삽입)로, 어두운, 더 세분화, 이하 동질 나타날 수 있습니다.
  3. 50 μl에 pipetteman 세트로, 200 μl 피펫 팁을 사용하여 먼저 우물에서 미디어를지고 끝 오줌에 배출. 그런 다음, 부드럽게 빠르게 팁 (그림 1B)로 흡입하여 식민지를 제거합니다 매체의 50 μl이 박탈되기 전에 끝으로 식민지를 자극.
  4. 줄기 세포 매체 (그림 1C)의 100 μl로 inactivated 피더 세포를 포함하는 48 잘 접시의 잘 하나에 식민지를 포함하는 매체를 배출.
  5. 단계를 반복합니다물론 당 500 μl를 초과하지 않고 같은 잘 ~ 8 식민지로 4.3과를 추가 할 수 있습니다.
  6. 통과 한 SSC의 식민지로 48 잘 접시의 추가 우물을 준비하는 4.3-4.5 단계를 반복합니다.
  7. 웰스는 7-14일 또는 최대 500 세포 (그림 1D) 부상하는 큰 clumps 후 분할 할 준비가 될 것입니다.

5. 분쇄에 의한 SSCs의 후속 확장 및 Passaging

  1. 통로 한 곳에서 셀은 1시 6분 (매 7 일) 이후에 다음과 같이에 처음 3 구절에 대한 1시 2분의 분할 비율로하고 1시 4분 14 일 이후에 새로운 피더에 최대 subcultured해야합니다. 부드럽게 세포에서 매체를 세정하여 1 ML 피펫 팁을 준 합류 잘 나가지 식민지 (예를 들면 ~ 300,000 SSCs / 잘 6 잘 접시의) 씹다. 식민지는 분리 볼 수 있습니다. 액체의 흐름과 너무 많은 힘이 원치 않는 피더 세포가 너무 내려 와서하게됩니다.
  2. 300 XG에서 원뿔 튜브와 원심 분리기에 triturated 세포를 수집5 분 거리에 있습니다. 참고 : 탐정이 원하는 경우 trypsinization 단계가 안전하게 여기에 추가 할 수 있습니다.
  3. 표면에 뜨는을 대기음 철저히 식민지를 방해하고를 아래로 pipetting하여 신선한 줄기 세포 매체에 다시 일시 중지합니다.
  4. 미토 마이신-C와 inactivated 신선하게 조리 된 피더 세포에 판 SSCs는 제 1 절에 설명되어 있습니다.
  5. 세포에게 주당는 다음 세 번 먹이. 첫 번째와 두 번째 수유를 들어 (예 : 월요일, 수요일) 신선한 매체의 볼륨에 의해 50 %를 추가 할 수 있습니다. 셋째 수유를 들어 (예 : 금요일), 모든 매체를 대기음 2 ML 신선한 매체로 대체합니다. 접시는 7~10일에 합류 될 것입니다. 문화는 체세포의 세포 10 일부터 배아 세포를 구별 할 (예 : 손쥐 세균 세포 마커 GCNA를 사용하여) immunostaining에 따라 5-7 통로 후> 98 %의 배아 세포 (즉, <1 % 오염 체세포 세포)로 구성해야합니다. 참고 :이 방법은 기관에 의해 명시된 규정 및 요구 사항을 준수 개발웨일 코넬 의과 대학에서 알 동물 관리 및 사용위원회.

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결과

통로 제로 야생 타입의 외관, 7 일 후에 성인 SSC의 식민지는 그림 1에 표시됩니다. 입체 식민지가 상단에 성장 SSCs의 여러 레이어와 피더에 의해 증착 모이통 또는 부하 세포 외 기질에 부착 된 평면 세포의 층으로 구성되어 있습니다. 건강한 SSCs는 밝은 refractile하고 균일 11-12 μm의 직경 있지만, 셀 테두리는 구분하기가 어렵 있으며, 콜로니의 크기가 아니라 내에서 서로 다른 생쥐에서 준비 우물 사이에 높은 변수가 될 수 있습니다. 식민지의 시각화는 디지털 디스플레이와 초기 통로 (0-2) 문화에 존재하고 어떻게 매우 균일 한 SSC의 식민지와 오염 체세포 세포 사이의 대비를 향상 약간 드에 초점을 맞춘 초점 평면과 위상 현미경에 의해 도왔입니다 단단히 포장 식민지 (그림 1A는 삽입 참조) 형성하지. 피더 세포의 형태가 점차 AF 변경됩니다체세포 세포의 잔여 clumps가에 SSCs의 생존을 향상시키기 위해 생각되어 있기 때문에 적이는 미토...

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토론

성인 testis-파생 피더 세포를 사용하여 성인 SSCs를 파생를위한이 방법은 강력한이며, 일반적인 유전 적 배경 (예 : FVB, C57Bl6 및 혼합 129SV/C57Bl/6)과 다른 돌연변이 변종이 2,3,7,14을 고용했을 때 성공했습니다. 7 사실, 문화 시스템에 의해 생성 된 microenvironment는 생체에 성인 SSCs를 (- - / 동물 plzf의 경우 등) 유지에 유전 장벽의 일부를 극복하기에 충분합니다. 우리가 피더로 JK1 세포를 고용하지만, 비 변환 성인 고환 체세포의 세포는 JK1 세포 2,3 동등한 효과와 함께 사용할 수 있습니다.

SESC는 효율적으로 장기 성인 SSC 라인을 얻기 위해 설계되었습니다. 불행하게도, 높은 효율은 다음과 같은 이유로 트레이드 오프를 달성된다. 절차의 중요한 제한입니다 초기 도금시 필터링...

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공개 사항

MS는 JK1 세포를 배포 할 셀 Biolabs 주식회사에 라이센스를 통해 웨일 코넬 의과 대학에서 로열티를 받게됩니다.

감사의 글

이 작품은 건강의 뉴욕 국무부 (C026878)에 의해 지원되었다. MS는 뉴욕 줄기 세포 재단 - Druckenmiller 연구원이었다. 천 재단의 3 월부터 연구 기금 5 호 - FY11-571의 일부를 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 / 재료의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
DMEM 코닝 10-013 해리 버퍼에 대한 희석제
트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) Mediatech 25-051 - CI
줄기 세포 기반 매체 (StemPro-34) 생명 기술 10639-011 Shinohara 외에 따라 보완이 필요합니다. (2003) *
셀 중간 보충을 막기 여러 표 3을 참조하십시오 Shinohara 외에 따라 보완이 필요합니다. (2003) *
JK1 세포 셀 Biolabs 주식회사 CBA-315 당 Seandel 외 성인용 고환 stromal 세포로 대체 할 수 있습니다. (2007)
미토 마이신-C (주의) 시그마 - 알드리치 M4287 독성, 취급.
젤라틴 시그마 - 알드리치 G1890 물에 0.4 % 솔루션
EVOS XL 디지털 역 현미경 고급 현미경 그룹 -
표 1. 특정 시약 및 장비.
* 표 3을 참조
DMEM 코닝 10-013 해리 버퍼에 대한 희석제
트립신 (1:250) 생명 기술 27250-018 해리 버퍼 : 0.05 최종 % 중량 / 권
collagenase는 235 U / ML을 I를 입력합니다 워싱턴 CLS1 235 해리 버퍼 : 최종 0.03 % 중량 / 권
DNAse I Sigm- 올드리치 DN25 해리 버퍼 : 최종 80 U / ML
소 혈청 알부민 ICP 바이오 입 벌려 - 100g 해리 버퍼 : 0.5 최종 % 중량 / 권
표 2. 해리 버퍼
StemPro-34 SFM 생명 기술 10639-011
StemPro-34 영양소 보충 생명 기술 10639-011
추가 요금 **
비 필수 아미노산 시그마 - 알드리치 M7145 1X
가상 비타민 솔루션 생명 기술 11120-052 1X
L-글루타민 Mediatech 25-005 이 MM
소 혈청 알부민 ICP 바이오 벌려! 0.50 %
항생제 - Antimycotic 솔루션 Mediatech 30-004 - CI 1X
D (+) 포도당 시그마 - 알드리치 G8769 6 MG / ML
β-에스트라 디올 시그마 - 알드리치 E2758 30 NG / ML
progesterone Calbiochem 5341 60 NG / ML
태아 소 혈청 변하기 쉬운 N / A 1퍼센트
소 홀로 트랜스페린 시그마 - 알드리치 T1283 100 μg / ML
인슐린 쌍둥이 바이오 제품 700 112P 25 μg / ML
인간 GDNF 생활 Technologies PHC7041 10 NG / ML
인간 bFGF 생명 기술 PHG0023 10 NG / ML
마우스 EGF 생명 기술 PHG0313 20 NG / ML
putrescine 연구 유기물 0778P 60 μM
나트륨 Selenite 시그마 - 알드리치 S5261 30 NM
pyruvic 산성 알파 Aesar A13875 30 μg / ML
DL-젖산 JT 베이커 0196-04 1 μg / ML
β-메르 캅토 에탄올 생명 기술 21985-023 50 μM
아스 코르 비 산 시그마 - 알드리치 A4544 100 μM
D-비오틴 시그마 - 알드리치 B4639 10 μg / ML
표 3. 셀 매체를 줄기
* 참고 : 매체를 사용하기 전에 아래의 보충을 추가합니다. 필터 4 ° C.에 소독 및 보관 매체는 최소 2 주 동안 안정적이다.
** 우리는 어떤 명백한 해로운 영향없이 다른 제조업체, 제제 및 / 또는 이러한 시약의 로트 번호를 고용했습니다. 일반적으로 세포 배양 등급 시약을 고용해야합니다.

참고문헌

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