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방법 논문

마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

19.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50034

⸱

2012년 10월 29일

 ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

이 논문에서

요약

이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.

초록

담배 사용은 암, 심장 질환, 폐기종, 그리고 뇌졸중 등 수많은 건강 문제로 연결됩니다. 흡연에 중독 중추 신경계에 걸쳐 nicotinic 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)에 니코틴의 biophysical 및 셀룰러 행동에서 유래 유행 neuropsychiatric 장애입니다. 니코틴 중독과 관련된 뇌 영역에 존재하는 다양한 nAChR의 하위 유형을 이해하는 것은 중요한 우선 순위입니다.

이러한 전체 세포 패치 클램프 또는 두 전극 전압 클램프 녹음 등의 전기 생리학 기술을 채용 실험은 관심 nAChRs의 약리 특성에 유용합니다. 같은 포유류의 조직 배양 세포 또는 Xenopus laevis의 oocytes과 같은 세포 표현 nAChRs는 물리적으로 격리되어 있으며 따라서 쉽게 현대 약리학의 도구를 사용하여 공부하고 있습니다. 대상 수용체가 이미 알려진 특히 때 많은 진전은 이러한 기술을 사용하여 만들어졌습니다차 이소성 표현은 쉽게 달성했습니다. 심하게 실험실 쥐 쥐에서 채취 한 뇌 슬라이스 내의 뉴런에 : 종종, 그러나, 그것은 그들의 모국어 환경에서 nAChRs을 연구 할 필요가 있습니다. 예를 들어, 쥐 등 α4 L9'A 마우스 1 α6 L9 'S 마우스 2로 "지나치게"nAChR의 subunits을 표현, 특정 nAChR의 subunit 자신의 기능 표현을 바탕으로 뉴런의 모호 식별 할 수 있습니다. 뇌 조각의 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 녹음이 정기적으로 숙련 된 electrophysiologist에 의해 수행되어 있지만, 로컬 등 아세틸 콜린이나 뇌 슬라이스 내에 기록 된 셀 니코틴 같은 약물을 적용하는 도전입니다. superfusate에 약물의 희석은 (목욕 응용 프로그램) 빠르게 되돌릴 수 없습니다, 그리고 U-튜브 시스템은 쉽게 뇌 슬라이스와 함께 작동하도록 구성되지 않습니다.

이 논문에서, 우리는 빠르게 성인 m에 기록 된 뉴런에 nAChR - 활성화 약물을 적용하는 방법을 설명뇌 조각 ouse. 표준 전체 셀 녹음 조각의 뉴런로 만든되며, 이익의 약물로 가득 두 번째 micropipette는 기록 세포 근처의 위치로 maneuvered입니다. 약물 가득한 피펫에 가압 공기 또는 불활성 질소의 주입은 기록 세포에 피펫에서 배출되는 약물 솔루션의 작은 금액을 발생합니다. 이 방법을 사용 nAChR로 인한 전류는 밀리 초 정확도로 해결 될 수 있습니다. 약물 응용 프로그램 시간은 쉽게 변할 수 있으며, 약물이 가득한 피펫은 농도 - 반응 곡선은 단일 신경 세포를 만들 수 있도록 허용하는 새로운 피펫으로 후퇴하고 교체 할 수 있습니다. nAChR 신경 생물학의 맥락에서 설명했지만,이 기술은 뇌 조각의 뉴런의 리간드 - 개폐 이온 채널이나 수용체의 다양한 종류를 공부하는 데 유용해야합니다.

프로토콜

1. 뇌 슬라이스 준비 및 전기 생리학을위한 솔루션의 준비

  1. 뇌 조각의 준비를위한 솔루션은 이전에 3, 4를 설명했다. 93 N-메틸 D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 : N-메틸 D-glucamine (NMDG) 기반 다음과 같은 구성의 절단 및 복구 솔루션을 (MM)를 준비 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 + pyruvate, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. NMDG과 300-310 mOsm로 조절합니다. 10 N HCL을 7.3-7.4로 pH를 조정합니다.
    1. 각각의 2 M 주식 솔루션을 만들기 위해 Millipore 물에 MgSO 4 • 7H 2 O와 CaCl 2 • 2H 2 O를 해산.
    2. 나열된 순서에 다른 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면 작성Millipore 물 용적 플라스크입니다.
    3. pH를 측정하고 10 N HCL을 조정할 수 있습니다.
    4. osmolarity를​​ 측정하고 필요한 경우 NMDG을 조정할 수 있습니다.
  2. 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 다음 구성의 인공 뇌척수 (aCSF)을 (MM)를 개최 HEPES 준비 + pyruvate, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
    1. 나열된 순서의 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면, Millipore 물과 용적 플라스크를 채 웁니다.
    2. pH를 측정하고 필요한 경우 NaOH 또는 HCL을 조정할 수 있습니다.
    3. osmolarity를​​ 측정하고 자당 필요한 경우로 조정합니다.
  3. 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 포도당, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O에 다음 구성의 표준 aCSF 녹음 솔루션을 (MM)를 준비 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다.

2. 급성 뇌 슬라이스의 작성

  1. 이전에 3, 4에 설명 된대로 뇌 슬라이스 절단 및 복구가 이루어집니다. 버블이 결정 요리가 95 % 산소 / 5 % CO 2 가스 (carbogen), 얼음에 하나 접시, 33의 다른 ° ​​C.와 복구 솔루션을 NMDG로 가득
  2. 버블 크리스탈 1 요리 상온에서 carbogen과 aCSF를 개최 HEPES로 가득.
  3. 오세영 + pentobarbital (200 밀리그램 / kg, IP)로 성인 마우스를 (2~12개월 세) 마취. 동물이 발가락 - 핀치에 대한 응답이 없을 때 절차를 진행합니다.
  4. 필요한 경우, 나중에 genotyp에 꼬리 조직 샘플을 잘라동물 들죠.
  5. 가슴에 고인을 열고, 마음을 노출하고, 내림차순 대동맥 클램프. 오른쪽 심방을 괴롭히다.
  6. Transcardially 0-4 ° C NMDG 복구 솔루션의 5-10 ML과 동물을 perfuse.
  7. 동물 목을 벨, 뇌를 제거하고 1 분에 대해 4 ° C NMDG 복구 솔루션에 배치합니다.
  8. 얼음 차가운 금속 플레이트에서 관심 영역을 포함하도록 원하는 방향 (등, 수평, parasagittal, 코로나)에 뇌를 잘라.
  9. 접사 진동 슬라이서의 건조 단계 표면에 superglue과 뇌 블록 (DSK-제로 1; Dosaka), 4 잠기 뇌 블록 carbogen과 ° C NMDG 복구 솔루션, 그리고 지속적으로 거품 솔루션입니다.
  10. 관심 뇌 영역의 조각을 잘라. 슬라이스 두께는 특정 관심의 뇌 영역, 동물 연령, 수행 할 실험에 따라, 200-400 μm이다.
  11. 즉시 절단 한 후에 품다 원하는 슬라이스는 33 carbogenated ° C NMDG 복구 soluti정확히 12 분에에 후 60 분의 초기 기간 동안 솔루션을 개최 carbogenated, 룸 온도 HEPES로 전송할 수 있습니다. 이 60 분의 부화 후, 슬라이스는 녹음에 사용할 수 있습니다. 조각들은이 녹음에 사용되는 때까지 하루 종일 솔루션을 가지고 HEPES에 보관됩니다.

3. 뇌 슬라이스의 뉴런에서 패치 클램프 녹음

  1. 프로그램 불타는 브라운 풀러 (셔터 P-97 또는 이에 상응하는 수직 풀러)와 표준 패치 micropipette를 당겨. 기가 - 옴의 인감 형성을위한 최적의 아르 피펫은 일반적으로 MΩ 4-6의 저항이
  2. 수직 현미경 (니콘 FN-1)의 무대에, 녹음 챔버 (워너 인스트루먼트 RC-27L)에 한 조각을 전송합니다. 지속적인 superfuse (1.5-2.0 ML / 분) 32시 가열, 유지 carbogenated, 표준 기록 aCSF와 슬라이스 ° C. 또는 조각은 실온에서 유지 될 수 있습니다.
  3. 사용 관심 뇌 영역을 찾아 센터10X 공기 목적 (니콘 계획 형석 10X, NA 0.3, WD : 16mm).
  4. 40X에 가까운 적외선 (IR​​) 물 침적 목표 (; 0.80, WD : NA 니콘 APO 40XW 3.5 mm)을 사용하여 개별 뉴런 시각화 적외선 근처의 IR-차동 간섭 대비 (DIC) 광학 및 고속 연결이 커플 링 장치를 충전 (CCD) 비디오 카메라 (하마 마츠 C-7500). IR-DIC 관찰에서 건강한 뉴런은 부드럽고 밝은 회색 플라즈마 멤브레인을 나타냅니다.
  5. 적절한 세포 녹음 솔루션 micropipette를 입력합니다. 135 칼륨 글루 콘산, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 MG-ATP, 그리고 0.1 GTP (산도가 트리스베이스, osmolarity를 ​​7.25로 조정 : 대부분의 응용 프로그램의 경우, 우리는 다음과 같은 솔루션을 (MM)를 사용하여 290 자당과 mOsm)로 조정. 시각화 뉴런에서 전체 셀 녹음을 설정합니다.

4. 슬라이스의 뉴런에 대한 약물의 로컬 응용 프로그램

  1. 위에서 설명한대로 표준 패치 클램프 micropipette를 당겨. 사용여러 약물 솔루션은 동일한 휴대폰으로 사용할 수있는 경우 유리의 조각에서 두 개의 동일한 "자매"팁을 생산하는 셔터 P-97와 같은 피펫을 끌어 당기는이 바람직하다. 그들이 위에 설명 된 세포 솔루션으로 가득 된 경우 MΩ ~ 5의 저항이 것 팁 크기는 최적입니다.
  2. carbogenated, 표준 기록 aCSF에 희석 약물의 솔루션 백업은 micropipette. 아래 팁을 가리킨 솔루션의 항목에 갇혀있는 공기 방울을 제거 할 수있는 약물이 가득한 micropipette을 버려야지.
  3. 이러한 Picospritzer III (일반 밸브 (주))와 같은 적절한 압력 분출 시스템에 튜브로 연결 피펫 홀더에있는 약물이 가득한 micropipette를 탑재합니다. manipulators 일반적으로 (예를 들어, 셔터 MP-285) 패치 클램프 녹음에 사용되는 피펫 홀더는 동일한 해상도로 micromanipulator에 장착해야합니다. 또한, 머니퓰레이터는로와 슬라이스의에서 대각선 움직임을 허용해야합니다. 사람ually 유체의 열 뒤에 적절한 압력을 구축하기 위해 micropipette에 압력을 3-4 회를 꺼냅니다.
  4. IR-DIC 광학 아래의 팁을 시각화하는 동안 micromanipulator 컨트롤 사용하여 슬라이스에 약물 피펫을 낮 춥니 다. 이상적으로, 하나는 시각적으로 확인하고 센터 이전에 슬라이스에 기록 micropipette을 낮추는에 셀 근처의 약물 피펫의 위치 다음에서 기록 할 수있는 뉴런을해야합니다. 약물 피펫을 위치하면 약물 피펫은 gigaohm 인감을 맺은 후 위치로 이동하는 경우 녹화를 중단 할 수있는 기록 세포의 주변에 조직의 움직임을 일으킬 수 있습니다.
  5. IR 비디오 사용하여 조직 슬라이스의 상단 표면에 약물 micropipette를 배치. 한 압력 방출 및 모니터 1) 분사에 관한 파편의 움직임에 대한 팁 주변 및 팁이 막혔거나 차단되어있는 표지판 2) micropipette 팁을 실행합니다. 끝이 차단 / 막힌 경우, pipett를 철회전자하고 새로운 하나를 교체하십시오.
  6. 이러한 슬라이스의 상단에서 대각선 녹화 셀을 접근 그 마지막 위치에, 약물 가득한 피펫의 끝은 기록 된 셀 기록 전극의 끝과 같은 초점 평면 (또는 약간 아래)에 1) 인 경우 , 그리고 2) 기록 세포 10-40 μm. 약물 가득한 피펫 팁이 기록 된 셀 위에있는 경우, 압력 방출의 힘은 gigaohm 인감을 방해 수 있습니다.
  7. 전압 클램프 모드 또는 현재 클램프 모드에서 셀을 누른 상태에서 원하는 세포 반응을 기록합니다. 우리는 정기적으로 아세틸 콜린을 기록 및 / 또는 전압 클램프 모드에서 뉴런을 누른 상태에서 세포의 전류를 니코틴 -이 elicited. Picospritzer III를 사용할 때 압력 분사를 수동으로 트리거 될 수 있지만, 더 많은 재현 결과는 디지털 TTL 펄스를 수집 시스템 (축삭 Digidata 1440 및 pClamp 10.3)를 사용하여 압력 분사를 실행하는 것이 좋습니다.

5. 제어압전 번역기로 마약이 가득한 Micropipette

  1. 가능하면 단일 차원 압전 변환기에 약물이 가득한 피펫 홀더를 마운트 (예 : Piezojena PA-100 Burleigh PZM-150)가있는 아날로그 전압 입력 (다시 수집 시스템에서)을 허용 할 수 있습니다 고정밀 micromanipulator (셔터 MP-285)에 장착. 약물 가득한 피펫의 움직임에와 입국 / 출구의 타이밍과 속도를 포함하여 슬라이스, 부족이 더 쉽게 통제 및 실험에서 실험 재현 할 수 있기 때문 압전 번역 유용합니다. 피펫 만 압력 방출의 순간을 위해 압전 번역으로 셀 근처에 이동 될 때 nAChRs을 공부하면 약물이 가득한 피펫에서 니코틴 누설​​의 desensitizing 효과, 그들은 지금까지 발생한다 최소화하고 있습니다.
  2. 압전 전압 제어 증폭기에 수동으로 제어 포텐를 사용하여 전압을 다이얼의 최대 값.
  3. micromanipulator, 위치에게 피펫가 기록 된 셀에 내용을 추출하고, 수동으로 압전 전압 제어 증폭기에 0으로 전압을 줄여 피펫를 철회 할 슬라이스의 약물이 가득한 피펫을 사용합니다.
  4. 기록 수집 시스템에서 아날로그 출력 신호를 사용하여, 250의 압력 분출 TTL 펄스가 발생하기 전에 밀리 초 300 밀리 초를 시작 기간 동안 슬라이스로 약물이 가득한 피펫 이동합니다. TTL 펄스가 끝난 후에 50 밀리 초를 시작, 250 밀리 초 기간 동안 피펫을 철회.

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결과

우리의 실험에서, 우리는 정기적으로 도파민 (DA) 생산 복부 tegmental 지역 (VTA)와 substantia nigra 갈 거예요 compacta (SNc)의 뉴런을에서 기록합니다. 전압 클램프 모드에서 아세틸 콜린하거나 세포에 니코틴의 압력 응용 ​​프로그램은 일반적으로 100-200 밀리 초 (그림 1A-B)에서 정상에 도달 빠른, 안쪽 양이온 현재이 높아집니다. 현재의 부패는 크게 작업의 사이트에서 약물의 확산에 의해 결정됩니다, 그리고 슬라이스의 효소가 존재 여부를 비활성 형태로 약물을 흡수 할 수 있습니다. 예를 들어, 이크 DA 뉴런 5 풍부 뇌의 영역에서 세포의 표면에있는 acetylcholinesterases에 의해 빠르게 분해됩니다. evoked 현재 (그림 1A)의 급속한 붕괴에이 결과를 표시합니다. 반면, 니코틴 분해하고 니코틴-evoked 전류로 빠르게이 강하게 activ 할 수 전류 (그림 1B)를

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토론

본 논문에서 제시하는 방법은 뇌 슬라이스 준비에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 공부 폭넓게 유용합니다. 그러나, 상당히 실험 데이터이 방법을 활용에서 그 결과의 품질과 재현성에 영향을 미칩니다 요인이 있습니다. 예를 들어, evoked 전류는 약물이 가득한 피펫의 팁의 직경에 매우 민감합니다. 작은 팁 약물 솔루션, 낮은 저항을 제공하는 대형 팁이 기록 된 셀 기록 전극 사이의 gigaohm 인감를 중단 될 가능성이 높아집니다 꺼내기에 어려움을 초래하게됩니다. 제시된 방법의 또 다른 한계는 그 기록 세포의 10 μm 내에서 세포의 활동을 증가시킬 수 잠재적으로 기록 된 세포에 영향을 미칠 수있는 약물이 가득한 피펫에서 약물에 노출 될 수 있습니다.

같은 약물 피펫있는 셀을 여러 번에 약물을 적용하면 피펫을에게 반환하는 것이 중요합니다각 응용 프로그램에 대한 슬라이스에 정확히 같은 위치. 다음 한 응답 배치에도 작은 편차 (예 : 1-2 μm) 종종 관찰 피...

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감사의 글

이 작품은 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 DA030396에 의해 지원되었다. 도움이 토론과 원고의 비판에 대한 Drenan 연구실의 구성원에게 감사드립니다. 미의 특별 감사는 성인 마우스 뇌 조각에 대한 조언에 대한 기술 지원 및 조나단 토마스 팅에 대한 김 버렸네.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
이름 회사 소개 카탈로그 번호
N-메틸 D-glucamine 시그마 M2004
KCl 시그마 P3911
아냐 2 PO 4 시그마 S9638
NaHCO 3 시그마 S6014
HEPES 시그마 H3375
포도당 시그마 G5767
오세영 + 아스 코브 산 시그마 A4034
티오 우레아 시그마 T8656
오세영 + pyruvate 시그마 P2256
MgSO 4 • 7H 2 O 시그마 230391
CaCl 2 • 2H 2 0 시그마 223506
NaCl 시그마 S9625
오세영 + pentobarbital Vortech 제약 76351315
칼륨 글루 콘산 시그마 G4500
EGTA 시그마 E3889
MG-ATP 시그마 A9187
GTP 시그마 G8877
DSK-제로 1 기계를 진동 테드 펠라 주식회사
P-97 불타는 / 브라운 micropipette 풀러 셔터
RC-27 녹음 챔버 워너
TC-344B 재관류 히터 컨트롤러 워너 640101
SH-27B 솔루션 히터 워너 640102
니콘 FN-1 니콘
C-7500 CCD 비디오 카메라 하마 마츠
Picospritzer III 일반 밸브 (주)
MP-285 Micromanipulator 셔터
PA-100 압전 변환기 piezosystem 예나 주식회사
12V40 압전 증폭기 piezosystem 예나 주식회사
Axopatch 200B 분자 장치 업체
Digidata 1440A 분자 장치 업체

참고문헌

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