세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

요약

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

초록

박테리아 세포 분열이 midcell ^1,2에서 열 개 이상의 필수 단백질의 조율 조립이 필요합니다. 이 과정의 중심은 부문 계획 ^3,4에서 FtsZ 단백질의 링과 같은 suprastructure (Z-링)의 형성이다. Z-링은 여러 단일 좌초 FtsZ의 protofilaments로 구성되어 있으며, Z-링 안쪽에 protofilaments의 배열을 이해하는 것은 힘 발전기 ^5,6 등 Z-링 조립 및 기능의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 정보는 기존의 형광 현미경과 전자 현미경에 의한 전류 제한에 어려운 남아있다. 종래의 형광 현미경은 빛의 회절 한계 (~ 200 nm 정도)에 의한 Z-링의 고해상도 이미지를 제공 할 수 없습니다. 전자 cryotomographic 영상은 작은 C.에 FtsZ의 protofilaments을 분산 감지했습니다 crescentus 세포 ⁷ 만 같은 큰 전지에 적용하기 어려운대장균 또는 B. subtilis. 다음은 슈퍼 해상도 형광 현미경 방법의 응용 프로그램을 설명, Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)는 양적 E.의 구조적 조직을 특징하는 대장균 Z-링 ^8.

PALM 이미지가 모두 높은 공간 해상도 (~ 35 nm 정도) 및 대상 단백질의 모호 식별을 사용하려면 특정 레이블을 제공합니다. 우리는 405 nm의 ^9시에 활성화에 붉은 색 형광 (여기 = 561 nm의)에 녹색 형광 (여기 = 488 나노 미터)에서 전환 photoactivatable 형광 단백질 mEos2과 FtsZ을 표시. PALM의 실험이 진행되는 동안, 단일 FtsZ-mEos2 분자 stochastically 활성화되고 단일 분자의 해당 중심 위치는 <20 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. Z-링의 슈퍼 해상도 이미지가 검색된 모든 FtsZ - mEos2 분자의 중심 위치를 중첩에 의해 재건되어 있습니다. <P 클래스 = "jove_content">이 방법을 사용하여, 우리는 Z-반지 ~ 100 nm의 고정 폭을 가지고 있으며 가로, 세로, 높이로 서로 겹쳐 FtsZ의 protofilaments의 느슨한 번들로 구성되어있는 것으로 나타났습니다. 이 데이터는 Z-링 ^(10)의 세포주기에 의존 변경의 추가 조사를위한 발판을 제공하고 관심을 다른 단백질에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 변형 JB281의 단일 식민지로 LB 미디어의 예방 [BW25113 / pJB042 (P _라크 : FtsZ-mEos2)]. 37 흔드는에서 하루 아침에 성장 ° C.
2. M9에 ​​문화 1:1,000 ⁺ 최소한의 미디어 [M9 소금, 0.4 % 포도당, 2 MM MgSO _4, 0.1 MM CaCl _2, 가상 아미노산과 비타민]를 희석 중순 로그 단계 (= 0.2-0.3 OD _600)로 성장 실온 (RT)에서 chloramphenicol (150 μg / ML)의 존재 인치
3. 20 μM는 (주 # 1 참조) 2 시간에 IPTG와 문화를 유도.
4. 펠렛의 microcentrifuge (8,000 RPM, 1 분)의 문화와 M9 ^+의 동일한 볼륨에 resuspend, 반복. 두 번째 resuspension 후, 2 시간에 RT로 성장을 계속합니다.
5. 40 분 RT에서 PBS에 4 % paraformaldehyde (산도 = 7.4)로 유도 문화를 수정합니다. PBS의 동일한 볼륨에서 펠렛 문화와 resuspend, 반복. 영상 라이브 세포 경우, 동일한 볼륨으로 고정, 펠릿의 문화, ....

결과

위에 설명 된 PALM 이미징 메서드에서 생성 된 Z-링의 2 차원, 슈퍼 해상도 렌더링은 그림 3Aiv에 도시. 아래에, 우리는 그들로부터 얻을 수 질적 및 양적 정보를 요약.

질적, 우리는 Z-반지 종래의 형광 이미지 (그림 3A-Dii와 IV를 비교)의 구별없는 여러 구성 (싱글 밴드 또는 나선형 아크) 채택 불규칙한 구조입니다 관찰했다. 다음과 같은 관찰은 특정 구조 구성을 표시하는 셀 인구의 비율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 또한 양적 Z-링의 크기를 측정 할 수 있습니다. 링 폭과 직경을 결정하기위한 우리의 접근 방식은 단계 5.1에서 설명하고 그림 4에 설명되어 있습니다. 그림 4B에서 링 폭 나온했다113 나노 미터 (FWHM)으로 ermined. 이 값은 하나의 FtsZ의 p.......

토론

PALM 이미지는 다른 방법으로 달성하기 어려운 목표 단백질 분자의 분포와 배열에 대한 자세한 분석을 수 있도록 분자 수와 세포 내 위치에 대한 정보가 들어 있습니다. 다음은 PALM 이미지의 생물학적 관련성을 유지하면서 정확한 정량적 정보를 추출하기 위해 이동해야합니다주의 사항을 설명합니다. 우리는 또한 최고의 라이브 대 고정 셀을 사용하여 얻을 수있는 정보를 탐색. 마지막으로, 우리는 세포 분열 기계에 대한 추가 슈퍼 해상도 정보를 얻기위한 수단을 제안.

위에서 설명한 방법은 다음과 같은 방식으로 정확한 PALM 이미지를 생산하기 위해 최적화되었습니다. 첫째, 우리는 특징이며 Z-고리 구조 ^(10)의 신뢰할 수있는 마커 역할을하도록 융합 단백질의 기능을 최적화. 모두 이상 및 이하 표현 결과부터 융합 단백질의 두 번째, 우리는 미세 조정 표현비정상 구조 형성 ^10,12,13 인치 셋째, 우리는 형광 photoblinking 속성을 <.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
50 X 가상 아미노산	시그마	M5550
가상 비타민 100 X	시그마	M6895
IPTG	Mediatech	46-102 - RF
16 % Paraformaldehyde	전자 Micrsocopy 과학	15710-S
SeaPlaque GTG 아가로 오스	Lonzo	50,111
50 나노 미터 골드 비즈	마이크로 - Nanospheres	790113-010
FCS2 이미징 상공 회의소	Bioptechs
무대 어댑터	ASI	I-3017
역 현미경	하늘	IX71
1.45 NA, 60x 목표	하늘
IXON EMCCD 카메라	ANDOR 기술	DU897E
488-nm의 사파이어 레이저	응집성의
561-nm의 사파이어 레이저	응집성의
405 - 나노 미터 CUBE 레이저	응집성의