뮌헨의 Wistar 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 형광 고분자의 사구체 투과율을 정량화

요약

2 광자 현미경 높은 해상도 intavital을 활용하는 기술을 직접 시각화 및 표면 사구체에서 gloemrular 여과를 정량화한다. 이 방법은 정상과 질병 상태 모두에서 거대 분자의 투과 특성을 직접 측정 할 수 있습니다.

초록

같은 혈청 알부민, 긴 침투성 족으로 구성된 장벽, 혈관 내피 세포, 그리고 한마음으로 작업 기저막의 변화에​​ 의한 것으로 생각되어 같은 대형 필수 고분자의 소변 손실을 포함하는 신장 질환. intravital 2 광자 현미경을 사용하여 우리 연구소의 데이터는 근위 세뇨관 세포 (PTC)는 ^1,2 불리는 세포의 초기 집합에서 발생하는 필터링 알부민 검색과 이전에 생리 학적 조건에서 생각했던 것보다 더 투과성 사구체 여과 장벽 ^(GFB)를, 밝혀 ^3.

이전 기술은 신장 여과를 연구하는 데 사용 유체 콘텐츠 및 분석 ⁴ 샘플링이 초기 관 세그먼트의 루멘의 micropuncture을 포함 여과 장벽의 특성을 설정. 해당 밀접하게, 이러한 연구는 거의 존재하지 않는 것으로 내강 액에 알부민 농도를 결정일반적으로 소변에서 검출되는 것과. 그러나,이 기술에 의해 정의 된 크기의 덱스 트란 폴리머의 특성은 혈청 알부민과 비슷한 크기의 사람들을 밝혀 관 루멘과 소변에서 높은 수준을했다; 증가 투자율 ⁵ 제안.

여기에 직접 시각화하고 생체 내에서 사구체 형광 알부민 투과성을 계량하는 데 사용되는 기술에 대한 자세한 개요입니다. 이 방법은 보먼의 공간 (소변 여과의 초기 챔버)로 여과 장벽을 통해 여과 된 알부민을 검출 할 수 있고, 또한 근위 세뇨관과 이후 알부민 transcytosis ⁶ 시각화하여 알부민 재 흡수의 정량화 할 수 있습니다. 방광 도중에 이상 관 세그먼트에 따라 형광 알부민의 부재는 이전 근위 세뇨관 세그먼트에있는 검색 경로의 효율성을 강조 표시합니다. 또한,이 기술을 적용 할 때 투자율을 결정하기의 알부민 거의 동일 투자율 값으로 유사한 크기를 갖는 덱스 트란은 ^{2보고되었다.} 이러한 관찰은 직접 근위 세뇨관 세포 재생에 포함 된 변경에 많은 단백뇨 신장 질환의 초점을 확장 할 필요성을 지원합니다.

프로토콜

1. 설포-로다 민 101 포닐 염화물 (텍사스 레드) 알부민 쥐 혈청의 활용

1. 최종 농도 50 ML 원뿔 관에 15 밀리그램 / ML, 100 mM의 중조 산도 9.0의 쥐에서 (RSA) 혈청 알부민 6.667 ML 100 MG를 녹인다.
2. 장소 얼음 / 물 비커의 용액으로 0에서 11 ° C. 사이에 멋진
3. 15 초 동안 중간에 소용돌이, 텍사스 레드 포닐 염화물 (TRSC)의 10 mg을 유리 병에 고품질의 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 200 μl를 추가합니다.
4. 소용돌이 RSA 매체에 솔루션 용해 TRSC을 추가합니다.
5. 호일 랩 50 ML 원뿔 (형성 파라 필름이 단단히 밀봉을 보장하는 데 사용할 수 있습니다), 수평 W / 아이스 만과 장소 (거품 형성을 방지)을 천천히 솔루션을 선동하는 로커에 얼음 양동이에 장소는 반응이 0에서 계속할 수 4 ° C 1 시간 동안.
6. 0.9 % 생리 식염수 5 L를 확인하고 클립 하나) 투석 막을 수 있습니다 챔버 떨어져 컷 50 kDa의 분자량, B) 디 젖은플로트 - lyzer, 또는 c) 슬라이드 - lyzer 카세트 (접합 TRSC을 제거하기위한 모든 적절한)에서와 같이 투석 튜브.
7. 5 L 컨테이너 W / 0.9 %....

결과

그림 3은 뮌헨의 Wistar Frömter 쥐와 형광 알부민 투과성을 결정하기 위해 수행하는 단계의 표면 사구체에서 촬영 한 이미지의 예를 보여줍니다. 0.0111의 알부민 GSC 값은 뮌헨의 Wistar 쥐 때 공급 조건 ^3이 변형에서 볼 수있는 범위 내에서이 개별 사구체 가을을위한 것. 이 이미지에서 볼 수있는 안정성은 신중한 계획과 그림 1과 2에 묘사 된 명령어의 실행 때문이다. 앞에서 언급 한 바와 같이, 신장 exteriorizing에 사용되는 절개의 위치는 모션 아티팩트 무료로 안정된 이미지를 생산에서 가장 중요한 단계입니다.

토론

여기에서 강조하는 단계는 우리가들은 다음과 같은 함정을 피할 수 있기 때문에 일관되고 정확한 투자율 값을 생성 할 것 느끼는 것을 나타냅니다 :

1. 산란 : 긴 파장의 광자가 산란 적은 경향이 있기 때문에 적색 발광 형광체의 사용은 빛을보다 효율적으로 수집을 할 수 있습니다. 하나 녹색 또는 청색 발광 형광체를 사용하기 때문에 모세관 루프와 보먼의 공간 ^3에서 강도 값의 변동성이 증가의 GSC의 더 큰 변화를 소개합니다.
2. 이미지 깊이 : 깊은 3D 데이터 세트는 일반적으로 (종종 총 깊이 30 ~ 45 미크론 사이)에 수집되어 있지만, 상위 15 미크론 GSC 값을 결정하는 가장 적절한 초점 깊이를 나타냅니다. 다시 깊은 깊이 감도의 감소 및 방출 광자의 산란으로 인해 변동성이 증가된다. 더 중요한 것은 그러나 D를 발생 모세관 루프의 군집이다사구체 내 키퍼. 여기에, 모세관 루프 보먼의 공간을 둘러싼 보먼의 캡슐의 가장자리에 바싹 푸시됩니다. 이 실수로 직접 모세관 루.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Olympus Floview 1000 컨포칼/다광자 현미경	Olympus America		검출기용 필터: 파란색 430/100, 녹색 525/50, 빨간색 605/90
모드 잠금 Ti:Sapphire Mai Tai 레이저	스펙트럼 물리학		조정 가능한 여기 파장: ~750-1150nm
갈륨 비소 인화물 광검출기	Hamamatsu Corp		참고: 전면 또는 측면 장착 구성 사용 가능.
메타모프 이미지 처리 소프트웨어	분자 역학		참고: 버전 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 버전
핸들링 겸	전자 현미경 과학	Cat# 78266-04
Mayo 해부 가위	전자 현미경 과학	Cat# 72962
CA 마이크로 가위 모델 1C300	전자 현미경 과학	Cat# 78180-1C3
켈리 지혈 집게 (직선)	전자 현미경 과학	Cat# 72930
워터 재킷 담요 + 가열 패드	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 담요-66N111CC
Repti-Therm 언더 탱크 히터	ZooMed		RH-4
텍사스 레드 설포닐 클로라이드	바이러스/분자 프로브	Cat# T-353
쥐 혈청 알부민	시그마 알드리치	Cat# A-6272
고품질 무수 DMF	시그마 알드리치	Cat# 270547
Strate-Line 오토클레이브 테이프	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish 커버슬립 바닥 접시(50mm/40mm 커버슬립)	전자 현미경 과학	Cat# 70665-07

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