방법 논문

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마​​우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법

DOI:

10.3791/50092

⸱

2013년 4월 24일

1Department of Pharmacology, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Toledo

이 논문에서

요약

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실험 디자인은 태아의 뇌 임신 중 세포 사멸 및 신경성 펩타이드의 응용 프로그램에서 알코올 노출의 효과를 공부에 여기에 초점을 제안했다. 사육에서 태아 뇌의 컬렉션에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 세포 사멸의 결정을위한 기법도 자세히 설명되어 있습니다.

초록

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태아의 뇌 성장의 초기 배아 단계에서 태아 알코올 노출의 영향을 조사하는 실험 디자인에 도전하고 있습니다. 이 대부분은 태아의 뇌와 알코올 태아 노출로 인한 세포 사멸 세포의 결정에 대한 자신의 절편의 microdissection을의 어려움 때문이다. 실험은 태아의 뇌 조직에있는 세포 죽음의 식별 사육 쥐에서 시각화 기술을 제공합니다 여기에 설명. 본 연구에서는 C57BL 사용 / 알코올에 의한 세포 사멸에 대한 태아 알코올 노출과 영양 펩타이드의 역할을 연구 동물 모델로 6 마우스. 사육 배아 시대의 정확한 단계를 결정하기 위해 2 시간 매트 창으로 구성되어 있습니다. 설립 태아 알코올 노출 모델은 태아의 뇌에있는 태아 알코올 노출의 효과를 결정하기 위해 본 연구에서 사용되었다. 이것은 임신 한 쥐에 대한 영양소의 유일한 소스로 알코올이나 쌍 공급 액체 다이어트에 무료로 액세스를 포함합니다.

apoptosis를 조사를 위해, 태아의 두뇌가 먼저 vibratome 기기와 함께 자신의 절편을 촉진하기 위하여 필 - 멀리 금형을 사용하여 젤라틴에 포함됩니다. 파라 포름 알데히드에 포함 된 고정 태아의 뇌는 쉽게 단면이며, 무료 부동 섹션은 세포 사멸 또는 세포 죽음의 결정에 superfrost 플러스 슬라이드에 장착 할 수 있습니다.

TUNEL (TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 전이 터미널 deoxynucleotidyl) 분석은 세포 사멸 또는 사멸 세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 그것은 주목할만한 그 APoptosis 및 세포 매개 세포 독성은 DNA 파편을 특징으로하고 있습니다. 따라서, 시각 TUNEL 양성 세포는 세포 사멸 또는 세포 사멸 세포의 지표입니다.

여기에 실험 디자인은 태아 두뇌에 임신 중에 알코올의 영향을 연구 설립 액체 다이어트의 사용에 대한 정보와 신경성 펩티드의 역할을 제공합니다. 이 번식 임신 한 쥐를 먹이 태아의 두뇌를 microdissecting 및 세포 사멸을 결정을 포함한다. 함께, 이러한 시각 및 텍스트 기술은 태아 두뇌에 유해한 에이전트의 태아 노출 조사를위한 소스가 될 수 있습니다.

서론

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여기에 설명 된 실험 방법의 목표는 먹이 microdissecting 및 세포 죽음을 감지, 번식과 관련된 여러 가지 기술을 사용하여 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 효과를 평가하는 것입니다. 우리 실험실에서 작업 알코올의 양 기간에 인간 마시는 패러다임과 유사 할 수있는 적당한 음주의 모델로 알코올과 혼합 액체 음식을 포함했다하면 1-5 소비. 우리와 다른 태아 알코올 노출의 해로운 영향으로부터 신경 세 가지 펩타이드 유도체를 발견했습니다. 동물 모델을 사용하여 배아 단계에서 알코올 노출을 조사 연구는 신경 보호의 잠재적 인 메커니즘의 신분으로 이어질 중재 절차의 개발을 허용 할 수 있습니다. 이 임신 중 알코올 노출의 해로운 효과의 신경 효과와 감쇠에 대한 충분한 정보를 제공 할 수 있습니다.

태아 알코올 노출의 영향을 가능한 한 방지 체외 6,7와 in vivo 1,2,4,8,9의 신경 보호에 관여하는 것으로 알려져있다 펩타이드와 임신 한 생쥐의 치료를 포함 할 수 있습니다. 이러한 펩타이드 중, ADNF-9 또는 SAL로 알려진 SALLRSIPA은, 활동에 따라 신경 영양성 인자 (ADNF) 7,10에서 파생됩니다. 순서 ....

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프로토콜

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1. 동물 사육 및 영양 펩타이드 치료

  1. 2 시간 동안 남성의 홈 케이지에 암컷 생쥐 (~ 육주 세, 평균 체중 20g)을 배치하여 품종 C57BL/mice.
  2. 즉시 나중에 정자 플러그 및 / 또는 질 세포진 검사를 확인합니다.
  3. 긍정적 인 경우, 배아 0 일 (E0)로이 시점을 지정합니다.
  4. 최근에 설명 된대로 E7에, 제어 및 치료 그룹에 임신 한 암컷 체중 성냥 (3 그룹)가 할당됩니다 4 : 1) 알코올 (에탄올) 액체 다이어트 그룹 (ALC), 2) 쌍 공급 대조군 (PF), 3) 알코올 노출 액체 다이어트 (ALC/ADNF-9)와 함께 ADNF-9 펩타이드의 복강 내 (IP) 주입을 받아야한다 펩타이드 치료 그룹. ALC 및 PF 다이어트의 준비의 세부 사항 및 IP 주사 절차는 우리의 최근 작업 4에서 찾을 수 있습니다.
  5. 영양의 단독 소스로 무료로 이용하실로 제공 할 수 있습니다 매일 알코올 액체 다이어트를 측정한다. PF 액체 다이어트 개별적 t 멍에O는 ALC 댐뿐만 아니라 매일 측정 할 수 있습니다.
  6. 이전 24 시간 동안 소비 된 액체 다이어트의 볼륨에서 녹음 할 수 있습니다 30 ML 스크류 캡 튜브를 졸업하고 갓 준비한 다이어트 ....

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결과

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실험 방법은 2 시간 사육 창 정확한 임신 단계를 추정하는 것이 필수적입니다 것을 보여 여기에 설명. 우리는 E13의 나이에 배아의 절개를 증명하고있다. 우리는 또한 E13에 태아 뇌의 microdissection을을 보여 주었다. 절차는 그림 1에서 설명한 여러 단계 (AC), 포함한다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초 (그림 1)을 해부한다. 태아의 뇌는 그 면역 탐지를위한 4 % 파라 포름 알데히드로 고정되어 있습니다. 고정 후, 태아의 뇌는 젤라틴 10 %에 포함되어 있으며 그림 2에 설명 된대로 vibratome는 단면을 준비했습니다. 태아 두뇌의 단계별 임베딩이 낮은 배율에서 수행되었다합니다. 내장 된 태아의 뇌는 그림 1의 높은 배율에서 시각화 할 수 있습니다. 또한, 전뇌에 신경절 예하의 수준에서 관상 태아의 뇌 섹션 수vibratome를 .......

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토론

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본 연구에서 제시 한 방법론과 기술은 태아 태아 두뇌에 알코올 노출과 이러한 효과의 예방에 영양 펩티드의 역할의 효과를 보여줍니다. 이들은 다른 임신 단계에서 남용 또는 태아 뇌의 다른 독성 화학 물질의 다른 약물을 연구하는 방법에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다.

사육 패러다임에 관해서, 어떤 경우에는 정자 플러그의 검출은 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 시점에서, 그것이 가능한 정자에게 긍정적 인 탐지를 제공 할 수있는 현미경 관찰에서 슬라이드 질 얼룩을 테스트하는 것이 중요합니다.

그것은 수유 PF 제어 및 알코올을 포함하는 액체 다이어트의 자유로운 접근을 포함하는 본 연구에 명시되어 있습니다. 적어도 30 습도의 %와 22-24을 초과하지 않는 온도 ° C 다이어트 1,2를 24 시간 무료로 이용할 중에 다이어트의 품질을 모니터링해야합니다. 또한 요구되는다이어트는 매일 신선한 준비하십시오. 공급 .......

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공개 사항

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어떤 공개가 이루어지지합니다.

감사의 글

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이 연구 프로젝트는 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에서 보너스 번호 R21AA017735 (YS)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알코올 남용 및 알코올 중독이나 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 또한이 원고를 편집 Charisse 몽고메리 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Superfrost Plus 슬라이드VWR48311-703
PAP PEN연구 제품 Int. Corp.
5-Plend Open Mailer Heathrow Scientific, LLCHS 15983G
필링 몰Electron Microscopy Sciences70182
현장 세포 사멸 검출 키트, PODRoche Diagnostics, Inc11684817910
Hanks' Balanced Salt SolutionInvitrogen14170-120
젤라틴 Type AFisherScientificG8-500
실체현미경W. NUHSBAUM, IncLeica M60, KL 200 LED
Micro-VibratomeLeica, IncLeica VT 1000S
Moria Ultra Fine Forceps Fine Science Tools11370-402
대학원 30ml 공급 튜브Dyets, Inc900012
Vitamin Mix Bio-Serv. Inc.F8031
미네랄 믹스바이오 서브 Inc.F8598
맥아당 덱스트린바이오 서브 Inc.3650
에틸 알코올 190 프루프, 5갤런111000190-SS05Pharmco-AAPER
정립 현미경W. NUHSBAUM, IncLEICA DM 4000
195506드 쌍

참고문헌

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  1. Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
  2. Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S.

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재인쇄 및 허가

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