애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

요약

애벌레의 zebrafish forebrain에서 세포 필드 잠재력을 기록하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 강력한를 제공합니다 생체 내 읽기에서의 활동 압수 같은. 이 기술은 간질 관련 유전자 또는 convul​​sant 약의 투여에 의해 evoked 발작을 들고 유전자 변형 zebrafish의 애벌레와 함께 사용할 수 있습니다.

초록

간질은 미국에서 3 백만 명에 이르는 사람들과 최대 50,000,000명 전 세계적으로 영향을 미칩니다. 자연 부당한 발작의 발생으로 정의, 간질은 뇌 또는 유전자 변이에 대한 모욕의 결과로 획득 할 수 있습니다. 동물 모델 압류에 대한 노력은 주로 활용 설치류의 모욕 (convul​​sant 약물, 자극 또는 뇌 손상)과 유전자 조작을 (안티센스 최저, 상동 재조합 또는 transgenesis) 획득했습니다. Zebrafish는 쥐 기반 간질 연구에 귀중한 대안을 제공 할 수 척추 모델 시스템 ^1~3아르. Zebrafish는 척추 동물의 유전자 또는 개발 연구에서 널리 사용되며, 포유 동물에 대한 유전 적 유사성의 높은 학위를 전시 및 알려진 인간 단일 유전자 간질 변이 ~ 85 %를 homologs을 표현한다. 때문에 자신의 작은 크기 (길이 4~6mm)로, zebrafish의 유충은 초기 개발 및 arra 동안 100 μl의 낮은 유체 볼륨에 유지 할 수 있습니다멀티 잘 접시에 yed. 시약은 배아는 약물 관리를 단순화하고 테스트 화합물 ⁴ 생체 검사에서 빠른 있도록 개발 된 솔루션에 직접 추가 할 수 있습니다. 합성 oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, 아연 손가락 nuclease와 유전자 변형 접근 방식은 빠른 속도로 ^5-7 zebrafish의 유전자 최저 또는 돌연변이를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 속성은 zebrafish 연구 한테 그런 간질과 같은 신경 질환의 연구에서 동물에 비해 전례없는 통계 전력 분석 이점을 여유. 간질 연구를위한 "금 표준"중앙 뇌 구조 (즉, 발작), 효율적으로 애벌레의 zebrafish의 뇌 활동을 기록하는 방법에 발생한 이상 전기 방전을 감시하고 분석하는 것입니다 때문에 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 기존의 세포 녹화 기술의 적응이며, 그대로 zebrafish 애벌레의 뇌 활동의 안정적인 장기 모니터링 할 수 있습니다. 에스충분한 녹음은 유전자 변형 물고기에 기록 convul​​sant 마약과 자연 발작의 목욕 응용 프로그램에 의해 유도 급성 발작에 표시됩니다.

프로토콜

1. 계란 생산 및 수집

1. Zebrafish 축산는 이전 ⁸ 설명한 표준 절차를 따릅니다. 간단히, 성인 zebrafish는 장소에 디바이더와 탱크를 사육에 자리 잡고 있습니다. 방에 불이 다음 아침에 왔을 때, 디바이더는 탱크와 생선이 방해받지 결합 시간의 약 20-60 분 수 있습니다 사육에서 제거됩니다.
2. 번식 탱크에서 달걀은 스트레이너에 수집 달걀 물에 헹구어 있습니다. 달걀은 다음 달걀 물과 페트리 접시으로 전송됩니다. Unfertilized 달걀과 잔해가 전송 피펫을 사용하여 제거됩니다.
3. 보육에 수집 된 계란 (28-32 ° C)를 포함하는 장소 페트리 접시. 계란 이틀 후 수정을 (dpf) 주변, 부화 후, 전송 피펫과 융모막 및 기타 이물질을 제거합니다.
4. 원하는 일에 후 수정을 (3-8 dpf)는 실온에서 실험실 벤치에서 자유롭게 수영 유충과 장소를 포함하는 페트리 접시를 제거합니다.

2. Microelectrode 당겨 및 준비

1. micropipette의 풀러를 사용하여 1.2 mm OD 붕규산 유리는 바보 퍼티 램프 위에 누워하여 150mm 페트리 접시 또는 빈 피펫 상자에 두 개의 바늘과 가게에 모세....

결과

한천 - 임베디드 zebrafish 애벌레의 forebrain에 기록 electrographic 발작과 같은 방전의 예는 그림 1에 표시됩니다. 또는 1 밀리미터 picrotoxin (B에, 8 dpf),이 샘플에서 큰 진폭 멀티 스파이크 버스트 방전은 convul​​sant 약의 목욕 응용 프로그램을, 40 밀리미터 pilocarpine (6 dpf의)에 의해 evoked했다. 이 음반에 고정하고 한천 - 임베디드 zebrafish는 지속적으로 90 분에에 모니터링하고 있습니다. 물고기는 최대 24 시간까지에 대해 이러한 녹음 조건 하에서 가능한 상태로 유지됩니다. 약물은 입욕 매체와 30-45 분 이내에 애벌레의 zebrafish forebrain 활동을 유도 할 수있는 한천로 일반적으로 확산에 추가됩니다. 이 방법은 애벌레로 약물 솔루션의 비교적 작은 볼륨 (2-5 ML)와 함께 사용할 수는 지속적으로 살포를 필요로하지 않고 정적 목욕 구성 필요한 경우에 기록 할 수 있습니다. 패널 C에서 .......

토론

여기에 제시된 세포 녹화 방법은 뇌 활동의 매우 민감하고 빠른 분석이 가능합니다. 이 음반은 일반적으로 간질 환자 ^{11 12} 쥐 모델에서 비정상적인 전기 방전 (즉, 발작)의 존재를 평가하는 데 사용 electroencephalographic (EEG) 모니터링 유사합니다. 여기에 표시된대로 세포 녹음, 약리 조작과 함께 사용할 수 있습니다. 레코딩 이러한 유형의도 유전자 변형 zebrafish 잠재적 인 간질 phenotypes을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 돌연변이 zebrafish는 ENU mutagenesis의 화면 (Zebrafish 국제 리소스 센터를 참조에서 확인 많은 유전자 변이에 일반적으로 사용할 수 있습니다 http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php을 ) 또는 신흥 Tol2 유전자 변형 ⁷ 아연.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
아가로 오스 낮은 녹는	피셔 - 과학	BP1360-100	1.2 %에서 배아 미디어에서 디졸브
기록 미디어	피셔 - 과학	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 ㎜ NaCl, 2.9 MM KCl, 10 MM의 HEPES, 1.2 MM MgCl 2, 10 MM 덱스 트로 오스, 2.1 MM CaCl 2 1 N NaOH로 약 7.3로 산도를
Tricaine	은빛 연구소	MS-222	0.02 %
α-bungarotoxin	Bioscience Tocris	2133	1 MG / ML
모세관 유리 튜브	워너 악기	G120TF -3	MΩ이 -7의 저항에 당겨
패치 클램프 증폭기	워너 악기	PC-505B	우리는 전류 클램프 모드에서 워너 증폭기를 사용하여, 이득은 2K로 설정 2 MV / PA 및 베셀 필터에서 설정합니다. 비교 모델은 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다.
필터 / 앰프	백조 기술	FLA-01	10-20에서 설정 게인; 1 2K로 설정 컷 - 오프 주파수, 노치 필터에 우리는 백조 사전 증폭기를 사용합니다. 비교 모델은 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다.
축삭 A / D 보드와 Axoscope 소프트웨어	분자 장치	축삭 Digidata 1320A, Axoscope 8.2	데이터는 간격이없는 수집 모드를 사용 Axoscope에 수집, 10 kHz에서에서 샘플링. 비교 모델 및 프로그램은 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다.
달걀 물을	인스턴트 오션		3g 인스턴트 오션 바다 소금, 10 ML 탈 이온수 2 ML 0.1 % 메틸렌 블루