내피 glycocalyx의 기계적 특성은 AFM의 cantilevers에 마이크론 크기의 영역을 사용하여 들여 쓰기에 의해 측정되었다. 내피 세포는 glycocalyx 식을 유도하기 위해 생리 흐름 조건에서 사용자 정의 챔버에 배양 하였다. 데이터는 glycocalyx 두께와 탄성 계수를 결정하기 위해 박막 모델을 사용 분석 하였다.
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이 논문에서
요약
초록
백혈구 및 백혈구 캡처하는 동안 혈관 벽의 상호 작용에 대한 우리의 이해는 내피 표면 층의 기계적 성질의 불완전한 이해에 의해 제한됩니다. 이것은 백혈구의 접착 분자가 표면 지형 3 상대적으로 비 균일하게 분포되어 알려져 있습니다, 그 지형이 다른 표면 9 접착제 결합 형성을 제한, 그 생리 접촉 힘 (≈ 5.0 - microvillus 당 10.0 PN)는 등으로 microvilli을 압축 할 수 있습니다 반대 표면 3, 7 분자의 접근성을 증가 자신의 휴식 길이의 세 번째로 조금. 우리는 두 계층 구조, 상대적으로 강성 전지 본체뿐만 아니라 glycocalyx, luminal 표면 6 부드러운 보호 설탕 코팅으로 내피를 고려합니다. 그것은 glycocalyx는 내피 표면 4 백혈구의 접착을 줄이기 위해 장벽의 역할을 할 수 것으로 나타되었습니다.이 보고서에서 우리는 내피 기계 강성이 결합 형성에 영향을 미칠 수 방법을 이해하기 위해 내피 표면의 deformability를 해결하기 시작합니다. 정적 문화에 성장 내피 세포는 강력한 glycocalyx을 표현할 수 없지만, 생리 흐름 조건에서 성장 세포가 생체 2 관찰 대략 glycocalyx에 시작한다. 내피 세포 본체의 계수는 약 5-20 kPa 5로 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 측정되었습니다. glycocalyx의 두께와 구조는 전자 현미경 8을 사용 연구되었으며, glycocalyx의 계수는 간접적 인 방법을 사용하여 추정되었지만, 우리의 지식으로, 살아있는 세포에 glycocalyx 계수의 직접 측정 대한 출판 보고서가 없었습니다 . 본 연구에서는, 우리는 mA 자신의 glycocalyx 표현을 극대화 할 조건에서 배양 된 세포에 새로운 AFM 프로브로 만든 들여 쓰기 실험을 제시내피 glycocalyx의 계수와 두께 KE 직접 측정.
프로토콜
1. 방법
1.1 셀 흐름 상공 회의소
세포가 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단에 따라 성장 후 정신 병원 MFP3D AFM (산타 바바라, CA)에 직접 전달 될 수 있도록 그림 1에 표시된 흐름 챔버는, 건설되었습니다.
- 15 분에 한 후 증류수로를 세척 : 흐름 챔버 먼저 피라냐 솔루션 (H 2 O 2 3시 1분 H 2 SO 4) 유리 슬라이드를 청소하여 실험을 준비했습니다. 그들은 그 다음에 구운 된 건조하고 진공 증착 챔버에서 실란 aminopropyl의 triethoxy (APTES)을 코팅.
- 실리콘 가스켓은 실루엣 SD 절단 도구를 사용하여 절단되었습니다. 이것은 우리가 잘게 세포의 성장 동안 유량 및 전단 응력의 제어를위한 흐름 챔버 크기를 제어 할 수있었습니다. 일반적으로 채널은 0.4 mm의 실리콘의 시트에서 긴 19mm에 폭 6.4 mm를 잘라되었습니다. 장군에 필요한 유량테 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단 응력은 방정식과 사각형 채널에 판상 흐름을 가정 계산됩니....
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결과
전형적인 실험에서, 20 힘 - 대 - 거리 곡선은 근처 있지만 핵 (~ 2 μm 이내)에, 일반적으로 perinuclear 지역에서, 세포의 특정 지역에서 얻었다. 곡선은 측정 기간 동안 모든 샘플 드리프트에 대한 계정에 정렬 한 후 그림 4에 도시 된 바와 같이, 캔틸레버 노이즈를 제거하는 평균했습니다. 곡선 분석하고 얇은 폴리머 필름 (1)의 계수와 두께를 결정하기 위해 개발되었습니다 두 개의 레이어 모델에 맞게되었습니다. 25 세포의 곡선 맞게에서, 우리는 luminal 층의 계수가 0.7 ± 0.5 kPa이며, 그림 5와 같이 두께가, 380 ± 50 nm의 것으로 판정되었습니다. 전지 본체의 계수는 16 ± 6 kPa입니다. 이 값은 전지 본체와 glycocalyx 5, 8의 두께의 계수의 이전 측정과 좋은 계약입니다.
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토론
우리는 두 레이어 모델과 내피 벽에 혈액에 순환 백혈구의 상호 작용을 모델링 할 수 헤르츠 이론에서 계산 값을 사용했습니다. 우리는 10 PN 부하에 따라 50 nm의 직경이 백혈구에 microvillus가 glycocalyx에 약 150 nm의 들여 쓰기 것이라는 총 두께의 일부만 계산했습니다. 이이 실험에서 측정 된 특성을 가진 glycocalyx은, 세포 세포의 상호 작용에 중요한 장벽이며 세포가 백혈구 유착 동안 부착 캐스케이드 동안 극복해야 큰 steric 방해가 될 수 있음을 나타냅니다.
모델에서 등방성 탄성 구조와 glycocalyx을 우리가 대략 여기 사용됩니다. 우리가 표시 할 수있는 기계 측정 모르고 있지만이 경우하지 않습니다, 무슨 glycocalyx의 분자 구조에 대해 알려진 것은이 가능성이 과잉 단순화하는 것이 좋습니다. 사실, glycocalyx은 복잡하고 다양세포의 표면에 구조. 그것은 지향 분자 구조로 구성되어, 잘 정의 된 외부 경계를 부족하고,.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
저자는이 프로젝트와의 도움을 엘레나 Lomakina, 리처드 Bauserman, 마가렛 젊은, 셰이 Vaknin, 제시카 스나이더, 크리스 Striemer, Nakul Nataraj, 숙취 리 정, Tejas Khire, 그리고 에릭 램을 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH # PO1 HL 018,208로 운영되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 맥코이의 중간 | Gibco | 16600-082 | |
| 태아 혈청 | Hyclone | SH30070 | |
| 내피 세포 성장 매체 | VEC 기술 | MCDB-131 | |
| 풀링 된 인간 배꼽 정맥 내피 세포 | VEC 기술 | PHUVEC/T-25 | |
| 황산 | JT 베이커 | 9681-02 | |
| 과산화수소 | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | 올드리치 | 440140-100ML | |
| 이소 프로필 알코올 | VWR | BDH8999-4 | |
| 트립신 | Cellgro | 25-054-C1 | |
| 행크의 버퍼 소금 솔루션 | Gibco | 14175-095 | |
| sulfo-NHS-LC-비오틴 | 열 과학 | 21,335 | |
| Streptavadin 비즈 | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP - 3D AFM | 망명 연구 | ||
| Tipless Cantilevers | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| 실루엣 SD | Quickutz | 실루엣-SD | |
| 실리콘 고무 | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ML의 주사기 | 벤톤 디킨슨 | 309650 | |
| 18 게이지 바늘 | 벤톤 디킨슨 | 305196 | |
| 확장 세트 | Hospira | 4429-48 | |
| 4 방향 밸브 | Teleflex | W21372 | |
| 여성 / 남성 포트 캡 | 스미스의 의료 | MX491B | |
| 연동 운동의 펌프 | 왓슨-Marlow | 401U / D | |
| 연동 운동의 배관 | 왓슨-Marlow | 903.0016.016 | |
| 무균 필터 | 막 생활 과학 | 4652 |
참고문헌
- Clifford, C., Seah, M. Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios. Nanotechnology. , (2009).
- Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H.
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