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방법 논문

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

38.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50191

⸱

2013년 3월 28일

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

이 논문에서

요약

마우스의 흰색 지방 조직으로부터 격리 기본 흰색 preadipocytes는 베이지 색 / brite 세포로 구분 할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 백색 지방의 "브라우닝"의 분자 규정을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 모델 시스템입니다.

초록

브라운 adipocytes는 미토콘드리아의 호흡 사슬을 풀다 및 열 등의 화학 에너지를 발산 할 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 흰 지방 조직 (그래서 베이지 색 또는 brite 세포라고도 함)의 UCP1 - 긍정적 인 갈색 adipocytes의 개발은 매우 같은 만성 감기에 노출 또는 PPARγ의 agonists의 환경 단서의 다양한 의해 유도되며, 따라서,이 세포 유형에 대한 치료 대상으로 잠재력이있다 비만 치료. 대부분의 불후의 지방 세포 라인 문화에 흰색 지방의 "브라우닝"의 과정을 요점을 되풀이 할 수는 없지만, 기본 adipocytes는 brite / 베이지 색 세포 개발의 분자 제어를 연구하기위한 신뢰할 수있는 셀룰러 시스템을 제공 피하 화이트 지방 조직에서 stromal 혈관 분율 (와트)에서 분리 . 여기 주요 preadipocytes을 효과적으로 격리와 문화에 베이지 / brite 셀에 차별화를 유도를위한 프로토콜을 설명합니다. 브라우닝 효과는 갈색 지방 선택 마르크의 표현에 의해 평가 될 수있다같은 UCP1과 같은 ERS.

서론

비만은 크게 증가하고 세계이며, 지금은 공중 보건 1 가장 심각한 문제 중 하나를 간주됩니다. 이 조건은 지출에 대한 에너지 흡입 상대의 misbalance과 흰색 지방 조직 (와트)의 지질로 저장 초과하는 에너지의 결과에 관련되어 있습니다. 갈색 지방 조직은 열을 생산하기 위해 과도한 에너지를 발산 할 수있는 능력을 가지고있는 동안 확대 와트는 증가 몸 질량 및 무게와 연결되어 있습니다. 따라서 BAT은 춥고 비만 2,3 모두에 대한 보호 역할 할 수 있습니다. 이것은 단백질 1 (UCP1)를 uncoupling에 의해 미토콘드리아의 전자 교통 uncoupling에 의해 달성된다. 이 단백질은 BAT 3 thermogenesis를 nonshivering의 상징으로 간주됩니다. 최근 몇몇 연구는 성인 인간이 기능 BAT 4-8이 있으며, 따라서 인간의 BAT의 조작은 비만과 관련 질병과의 전투에서 잠재적 인 치료 개입 할 수 있다는 밝혔다.

jove_content는 "> 현재 증거가 갈색 adipocytes의 두 종류가 동물에 존재임을 나타냅니다;"고전 "또는"기존의 '갈색 지방은 태아 단계에서 개발 및 interscapular 지역과 다른 주변 조직에 헌신 갈색 지방 창고를 형성 반면. , 갈색 지방 (그래서 brite 또는 베이지 색 세포라고도 함)의 "inducible"형태는 사후 산후 단계에서 개발과 흰색 지방 조직에 사이 사이에 나타납니다. 갈색 adipocytes의 두 종류도 다른 발달 기원으로 구분되어 있습니다. 기존의 동안 갈색 adipocytes가 Myf5 전구체 myoblastsic 같은으로부터 발생, 와트 사이 사이 inducible 베이지 / brite 전지는 비 Myf5 계보 (Lineage) 9,10에서 발생. 또한,이 세포 유형의 규제 경로는 Myf5 파생 갈색과 다를 수 가능성이 adipocytes 11. 베이지 색 세포 (흰색 지방의 예 "브라우닝")의 개발은 만성 감기에 노출과에 대한 응답으로 활성화 할 수 있습니다β3-adrenoceptor-agonists 또는 성인 12-14에서 PPARγ의 agonists. 베이지 / brite 전지는 전체 에너지 균형의 조작을위한 유망 치료 표적이 될 가능성이 잠재적으로 비만 치료의 일부가 될 수 있습니다, 따라서, 환경 단서는 베이지 색의 개발을 제어하는​​하여 정확한 분자 메커니즘 및 신호 전달 경로를 이해하는 것이 중요합니다 세포.

흰색 지방의 갈변의 분자 제어를 이해하려면, 체외 실험에서 가장 preadipocytes 아니라 비동기 적으로 이루어집니다의 차별화로 적합하며 원위치 15 세포를 감지하기가 어렵습니다 수 있습니다. 지방 세포 개발에 연구가 지금까지 이러한 3T3-L1, 3T3-F442A 또는 HIB1와 같은 세포 라인에 주로 수행 된 있지만, 이러한 세포 라인은 베이지 색 세포의 분자 서명을 부족 나타납니다. 한편, 피하 와트로부터 격리 기본 adipocytes는 proces을 요점을 되풀이 할 가능성이 가장 높은셀 자치 패션의 흰색 지방의 갈변의 s입니다. 여기 지방 조직에서 stromal-혈관 분수의 효과적인 격리와 PPARγ의 agonists에 대한 응답으로 흰 지방의 갈변을 유도를위한 프로토콜을 제공합니다. Rosiglitazone은 이러한 세포의 갈변의 특히 효과적인 중재자로 표시되었습니다. 이전 16 제안으로 휴대폰이 시스템은 베이지 색 / brite 세포의 개발을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 시스템을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 소화 매체를 준비

조직 당 5 마우스 (약 1 ML / 1g의 지방 조직) 당 5 ML하십시오.

  1. 소화 효소에 무게 :
    - Collaginase D : 1.5 U / ML (1108874103, 1 G, 로슈, 70334223)
    - Dispase II : 2.4 U / ML (04,942,078,001, 0980 MG / lyo, 로슈, 11466200)
  2. 25 ML PBS를 추가하고 분해하기 위해 잘 섞는다
  3. 10 mm의 최종 농도에서 조직의 소화 직전에 CaCl 2를 추가

2. 마우스에서 지방 조직을 해부

  1. 절개는 신중하게 수행해야하고, 즉시 생쥐 후 (6~8주 세) 희생되어 있습니다. 을 열기 전에 마우스 모피에 뿌려 에탄올로 살균 작업 할 수 있습니다. 깨끗한 PBS, 별도의 interscapular BAT와 피하 사타구니 와트에 직접 조직을 놓으십시오.
  2. interscapular BAT의 경우 : 최대 직면 뒷쪽으로 배치 마우스를 뒷면과 목의 모든 길을 따라 자르면. 갈색지방 조직이 바로 어깨 (interscapular) 사이의 피부에서 볼 수 있습니다. BAT는 두 엽, 모양의 나비로 볼 수 있습니다. BAT를 덮고 흰 지방의 얇은 층은 신중하게 제거 할 것입니다.
  3. 피하 와트 (사타구니 와트)의 경우 : 피부를 제거합니다. 사타구니 와트는 내부의 고환을 향해 허벅지 아래로 거의 뒷면에 시작과 함께 가고, 양쪽의 피부 바로 아래에 자리 잡고 있습니다.

3. 지방 조직을 잘라 소화

  1. 빠르게 머리, 골격 근육 및 조직 섹션에서 결합 조직처럼 모든 오염을 제거합니다.
  2. PBS로 분해 매체를 희석하고 건조 판에 배치하지 않는 종이에 신속하게 조직을 말린다.
  3. 소화 매체 (사전 소화에 CaCl 2 추가) 및 작은 조각으로 조직을 잘게 썬 고기를 추가합니다. 5 ML의 피펫과 등을 아래로 pipetting하여 잘 섞는다. 소화 m의 나머지 50 ML 튜브에 다진 조직을 전송edium은 아래로 pipetting과가 더 섞는다.
  4. 다이제스트 37 ° C 40-50 분 150 rpm으로 일정하게 교반을 갖추고 있습니다. 소화가 잘되어 가고 이상 - 소화을 방지하기 위해 있는지 확인하기 위해 최선을 10-15 분을 확인합니다.

참고 : 올바른 소화 매체와 시간이 중요합니다. 조직이 잘 소화해야하지만, 초과 소화는 세포를 손상시킬 수 있습니다.

4. 필터 세포 현탁액

  1. 5 ML 전체 매체 (DMEM/F12가 포함 된 10 %의 FPS와 P / S)를 추가하여 소화를 중지합니다. 세포는 거의 동질해야합니다. pipetting으로 잘 섞는다.
  2. 10 분 700 XG에 원심 분리기.
  3. SVF는 이제 튜브의 바닥에 갈색 펠렛으로 볼 수 있습니다. 상단과 액체 층의 대부분에있는 기름 성숙한 지방 세포 층을 대기음 - 펠렛을 유지하고 10 ML 완전한 중간에 용해. 잘 섞는다.
  4. 새로운 50 셀 스트레이너 (50-70 μm의 직경을) 장소 ML 튜브와 세포 현탁액을 필터링합니다.

5. 판 셀

  1. 10 분 700 XG에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다.
  2. 10 ML 완전한 매체에 매체를 대기음하고 다시 일시 중지 펠릿. 피펫 잘 섞는다.
  3. 필요한 얼마나 많은 접시 견적. 이 다양하고 펠렛의 크기에 따라 달라집니다 수 있습니다. 일반적인 규칙은 사타구니 와트 5 마우스와 BAT 한 10cm 판에서 10cm 플레이트 2입니다.
  4. 완전한 중간에 콜라겐 코팅 요리에 플레이트 세포 (R & D)
  5. 1-2 시간 전지, 대기음 매체를 도금 후, 두 번 PBS로 씻어와 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 이 적혈구, 면역 세포 및 기타 오염 물질을 제거 할 수 있습니다으로이 단계는 중요합니다.

6. 셀을 차별화

  1. 유지 보수 및 유도 매체를합니다.

유지 보수 매체

추가 된 미디어를 작성하십시오

다닐 "> 인슐린, 최종 conc 5. μg / ML (5 MG / ML 주식, 산성화 물 산도에게 2.5를 준비하는 10 ML H 2 O의 아세트산의 *** 100 μl. 산성화 물에 인슐린을 분해. 스토어 재고에서 -20 ° C)

3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine (T3), 최종 conc. 1 나노 미터 (10 μM 재고, ***는 1N NaOH에 T3 분해 및 10 μM 주식을하기 위해 매체를 추가 할 수 있습니다. 시그마 고양이 # T-2877)

4 번 스토어 ° C, 일주일 동안 좋은

유도 매체

다음 화합물을 포함하는 유지 보수 매체 :

인도 메타 신, 최종 conc. 125 μM (에탄올 0.125 M 주식, 시그마 고양이 # I-7378). 인도 메타 신은 60로 가열해야 ° C 용해되어 있어야합니다.

Dexamethasone, 최종 conc. 2 μg / ML (에탄올의 2 밀리그램 / ML 양말, 시그마 고양이 # D-1756)
3 - 이소 부틸-1-methylxanthine (IBMX), 최종 conc. 0.5 ㎜ (DMSO의 0.25 M 재고, 시그마 고양이 # I-5879)
Rosiglitazone, 최종 conc. 0.5 μM(DMSO 10 MM 주식, 시그마 고양이 # R-2408)

참고 : 때마다 중간 신선한 유도하십시오.

  1. 전체 미디어에서 95~97%의 합류 (합류하지만 너무 포장되지 않음)에 기본 adipocytes 성장
  2. 유도 매체 (일 0)와 함께 정기적으로 전체 매체를 변경
  3. 48 시간 (2 일) 후, rosiglitazone (0.5 μM)와 유지 보수 매체로 매체를 변경
  4. 추가 48 시간 (4 일) 후, 추가 2-3 일 동안은 rosiglitazone과 신선한 유지 보수 매체 (1 μM)로 변경합니다. 6-7일 유도 매체를 추가 한 후, 세포가 완전히 지방 세포를 성숙하고 차별화되어 있으며 기름 방울로 가득합니다. 작은 물방울이 유도 한 후 3-4일 주위에 나타납니다.

참고 : 변경 매체는 세포가 완전히 구별 모든 2~3일 때까지.

전지는 지금 수확하고 Ucp1와 인접의 mRNA 표현 될 수있다R 갈색 지방 세포에 특정한 유전자가 qRT-PCR로 측정 할 수 있습니다. 서양 얼룩은 단백질을 감지하는 데 사용됩니다.

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결과

주요 adipocytes의 브라우닝은 mRNA의 Ucp1의 표현과 qRT-PCR로 다른 갈색 지방의 특정 또는 선택적으로 유전자를 측정하여 액세스 할 수 있습니다. 그림 1에 제시하는 것은 사타구니 와트 - 파생 주요 adipocytes에서 유전자 발현 데이터입니다. 세포는 각각 50 nm의 500 nm의에서 rosiglitazone 두 가지 복용의 면전에서 차별화 유도했다. 셀의 하위 집합을 수확하기 전에 4 시간 10 μM에서 forskolin로 치료했다. 이것은 세포의 주기적-AMP (CAMP)를 유도하고 Ucp1 표현을 포함 thermogenic 유전자 프로그램을 활성화합니다.

그림 1A에 도시 된 바와 같이, rosiglitazone은 견고 Ucp1 mRNA의 표현을 유도. Forskolin 처리 (캠프) 추가 rosiglitazone 유발 UCP1 식을 증대...

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토론

여기 마우스의 기본 양식 adipocytes에 베이지 색 / brite 세포의 개발을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 시스템을 제시한다. 같은 몇 가지 가능한 불후의 세포 라인에 비해,이 시스템은 생체의 흰색 지방의 갈변으로 향상된 관련성을 제공 할 것으로 예상됩니다.

이러한 기본 adipocytes의 연구는 몇 가지 장점을 제공하더라도,이 또한 고려하는 것이 중요 일부 제한 사항 및 문제를 존재합니다. 첫째,이 시스템은 세포의 분화의 효력에 크게 의존합니다. 이러한 Ucp1 및 Cidea과 같은 갈색 지방 선택적 유전자의 표현은 특히 차별화에 따라 달라집니다. 예를 들어, PPARγ의 agonists와 BMP7도 따라서 adipogenesis을 강화, "브라우닝"효과는 상당히 차별화의 유사한 정도와 셀에 액세스해야합니다. 또한, 같은 지방 선택적 갈색의 표현을 정규화, 인물 1D와 E에

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공개 사항

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

감사의 글

우리는 토론, 기술 지원 및 원고에 대한 편집 지원 Haruya 오노, Kosaku 시노다, 루이스 샤프, 에미 Tomoda, 로렌 루이즈 감사드립니다. 이 작품은 돌파구 바이오 메디컬 연구 및 Asubio 알약 주식회사에서의 프로그램에서 SKULA에 NIH (DK087853)에서 보조금 코펜하겐과 EU FP7 프로젝트 DIABAT (건강-F2의 대학에서 SHARE 박사 장학금이 지원 한에 의해 지원되었다 리자 매드슨와 Karsten Kristiansen에 -2011-278373). 우리는 또한 DERC 센터 보조금 (NIH P30 DK063720)을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
Collaginase D 로슈 11088874103
Dispase II 로슈 04942078001
CaCl 2
DMEM 매체 어부 10017-CV 나트륨 pyruvate없이 2,5 g / L 포도당 및 L-글루타민과 함께
인슐린
T3 (3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine) 시그마 T-2877
인도 메타 신 시그마 I-7378
Dexamethasone 시그마 D-1756
IBMX 시그마 I-5879
Rosiglitazone 시그마 R-2408
장비
콜라겐 코팅 요리 BD 354450 10cm 플레이트
70 μm 필터 BD 팔콘 352350 셀 스트레이너, 70 μm 나일론 1/ea

참고문헌

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