오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정 Xenopus Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

우리는 동위원소 실험실에 대한 접근, 안전 요구 사항 또는 리튬의 경우와 같이 매우 짧은 붕괴 시간으로 인해 사용할 수 없을 수도 있는 값비싼 방사성 동위원소의 사용과 관련된 제한을 피하기 위해 이온 전위막 단백질의 특정 수송 활성을 조사하기 위해 방사성 추적 실험에 대한 민감하고 안전하며 저렴한 대안을 개발하고 싶었습니다. 우리는 특히 전기중립으로 작동하는 위 H⁺,K⁺-ATPase의 활성을 결정하는 데 관심이 있었는데, 그 이유는 효소가 전류를 생성하지 않기 때문에 그 활성은 전기생리학적 방법으로 해결할 수 없기 때문입니다. Na⁺,K⁺-및 H⁺,K⁺-ATPase는 Rb⁺를 K⁺(및 Li⁺)만큼 효율적으로 수송하기 때문에 루비듐 또는 리튬에 대한 AAS 기술의 높은 감도는 수송 활동의 민감한 검출을 용이하게 합니다. 원자 흡수 분광 광도계는 화학 실험실에 널리 분포되어 있으며 많은 관심 있는 과학자들이 접근할 수 있어야 하는 일반적인 분석 장치입니다. 또한, 우리는 단일 배치 내에서 단백질 발현 수준과 관련하여 현저하게 낮은 세포 간 변동성을 달성할 수 있는 큰 단일 세포(약 1.0-1.5mm 직경)를 활용하는 Xenopus 난모세포 발현 시스템을 활용하고 싶었습니다. THGA-AAS 기술을 사용한 루비듐의 검출 한계(특성 질량)는 10pg 또는 1.2·^10-13mol(Rb: 85.47g/mol)이고, 리튬의 경우 5.5pg 또는 7.9·^10-13mol(Li: 6.94g/mol)입니다. 제노푸스 난모세포에서 Na⁺,K⁺-ATPase의 이종성 발현에 따라 100nA의 펌프 전류가 달성될 수 있으며(이는 초당 약 6.2·1011 기본 전하 또는 1.03·^10-12 mol ^s-1과 동일) 따라서 1분 이내에 6·^10-6C의 전하가 수송됩니다. 하나의 순 전하의 수송은 두 개의 Rb⁺ 이온의 흡수에 해당하기 때문에(3Na⁺/2K⁺ 화학량론으로 인해) 1분 동안 100nA 전류는 1.2·^10-10 mol Rb⁺의 흡수에 해당합니다. 따라서 1,000배 희석(1ml 물에서 약 1μl 부피의 난모세포의 균질화)에서도 일반적인 THGA-AAS 샘플(20μl)에는 검출 임계값을 훨씬 초과하는 2.4·^10-12mol Rb⁺(또는 204pg)가 포함되어 있습니다. 따라서 수송 활성이 100배 이상 낮거나 원형질막 발현이 낮은 수송체라도 실험의 플럭스 시간을 적절하게 조정하여 이 기술로 분석할 수 있습니다.

펌핑 속도는 온도에 민감하게 의존하기 때문에(Na⁺,K⁺-ATPase에 대한 일반적인 활성화 에너지는 90kJ/mol - 130kJ/mol^1-3 범위이며, 이는 20°C에서 22°C로 변화할 때 회전율이 약 30% 증가함), 잘 평형화된 버퍼 용액을 사용하여 정밀한 온도 제어(에어컨) 하에서 플럭스 측정을 수행해야 합니다. 또한, 난모세포는 이온 수송체의 발현을 위한 균질한 크기와 관련하여 신중하게 선택해야 합니다. 이러한 예방 조치를 통해 실험 조건당 약 10개의 세포에서 10% 미만의 실험 표준 오류를 일상적으로 달성할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 예를 들어 양이온 수송^4-6의 명백한 Rb⁺ 친화도, 세포 외 및 세포 내 pH⁷의 영향 및 수송 중 양이온 배당에 관여하는 잔류물의 돌연변이 효과를 결정할 수 있었습니다^4,8. 이 기술의 장점은 이온 플럭스를 난모세포의 2전극 전압 클램핑과 함께 측정할 수도 있다는 것인데, 이는 한편으로는 수송 중 멤브레인 전위의 정확한 제어를 보장하고 다른 한편으로는 이온 플럭스를 멤브레인 전류와 연관시킬 수 있습니다. 따라서, Na⁺,K⁺-ATPase의 3Na⁺/2K⁺ 화학량론을 검증하고(아래 예시적인 결과 참조) 위 H⁺/K⁺-ATPase⁷의 양이온 수송의 전압 의존성을 결정할 수 있었습니다.

1. Xenopus 난모세포의 cDNA 구조 및 단백질 발현

관심 멤브레인 단백질의 cDNA는 pTLN⁹ 또는 pcDNA3.1X¹⁰과 같은 Xenopus laevis 난모세포에서 발현하기에 적합한 벡터로 클로닝되어야 합니다. 이러한 최적화된 벡터는 다중 클로닝 사이트(MCS) 옆에 있는 Xenopus laevis β-글로빈 유전자의 5' 및 3'-비번역 영역(UTR), 5' UTR 앞에 위치한 RNA 중합효소 프로모터 서열(pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7), 세포 내 cRNA 안정성을 보장하기 위해 MCS의 3' 방향으로 poly-A 스트레치, 그리고 더 나아가 플라스미드의 선형화를 위한 또 다른 단일 절단 제한 엔도뉴클레아제 부위의 또 다른 서열을 포함하여 다음을 위한 주형으로 작용합니다.in vitro cRNA 전사.

과발현된 인간 Na⁺/K⁺-ATPase (α_2-subunit+β_1-subunit)의 활성을 난모세포의 내인성 Na⁺/K⁺-ATPase와 구별하기 위해, 돌연변이 Q116R 및 N127D를 도입하여 밀리몰 범위¹¹에서 IC50을 가진 와바인 저항성 단백질을 얻었다. H⁺/K⁺-ATPase의 경우, Rb⁺ 플럭스가 전압 클램프 형광측정법(VCF) 실험의 동역학 데이터와 상관관계가 있었기 때문에 H⁺/K⁺-ATPase α단위체 돌연변이 S806C를 사용하여 플럭스 측정을 수행했습니다. VCF 기술(https://www.jove.com/video/2627/ in-situ-with-site-with-site-directed-fluo rescence-labeling)¹²은 효소의 구조적 변화를 보고하는 전략적으로 도입된 시스테인 잔기에 대한 형광단의 부위 특이적 부착을 기반으로 합니다.

2. DNA 템플릿의 선형화 및 정제

1. DNA 템플릿의 선형화를 위해 37°C에서 1시간 동안 제한 효소에 적합한 5μl 10x 농축 완충액과 10U의 제한 효소를 사용하여 50μl 반응 부피에서 3μg의 플라스미드 DNA를 분해합니다.
2. High-Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science)를 사용하여 선형화된 DNA를 정제합니다. 먼저 350μl 결합 완충액(구아니디늄이소티오시아네이트 함유)을 분해 바이알에 추가합니다. 이 정제 단계 후, guanidiniumisothiocyanate는 효율적인 단백질 변성제이며 분자 생물학 실험실에서 자주 발생하는 오염 물질인 RNAse를 파괴하기 때문에 선형화된 DNA 템플릿은 'RNA 등급'입니다.
3. spin column을 수집 튜브에 삽입하고, 2단계의 DNA 용액을 컬럼에 로드하고, 13,000 x g에서 30초 동안 원심분리한 후 flow-through를 폐기합니다.
4. 컬럼에 500μl의 세척 버퍼를 추가합니다. 13,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 사용하고 플로우 스루를 폐기합니다.
5. 컬럼에 200μl의 세척 버퍼를 추가합니다. 컬럼을 완전히 건조시키기 위해 13,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 사용합니다.
6. 스핀 컬럼을 새 1.5ml Eppendorf 튜브에 넣고 컬럼에 뉴클레아제가 없는 정제수(Ambion Product # AM9937) 50μl를 추가합니다. 최대 속도로 1분 동안 원심분리하여 용리합니다.
7. 용출 후 DNA 함유 용액을 약 15μl로 농축합니다. 이 단계는 용액에 3μl에 0.5μg의 선형화된 DNA가 포함되어 있는지 확인하며, 이는 다음 in vitro cRNA transcription reaction에 권장되는 농도입니다.

3. In Vitro cRNA 합성

1. 플라스미드(SP6, T7)의 프로모터 염기서열에 따라 적절한 mMessage mMachine Kit(Ambion Product #1340, #1344)를 선택합니다. 10 μl의 총 반응 부피에 이전 단계의 선형화된 DNA 3 μl와 전사 완충액 1 μl를 NTP-cap mix의 사전 분주된 5 μl 샘플에 추가합니다. NTP-cap 혼합물의 사전 분취는 뉴클레오시드-삼인산의 분해로 이어질 수 있는 잦은 동결-해동 주기를 피하기 위해 필요합니다. 마지막으로, 적절한 RNA 중합효소 1μl를 첨가하고 간단히 혼합한 후 반응 혼합물을 스핀다운합니다.
2. 반응 혼합물을 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다. 배양 시간은 2시간을 초과해서는 안 되며, 이는 cRNA 수율 또는 품질을 저하시킬 수 있기 때문입니다.
3. 키트에서 얼음처럼 차가운 3M LiCl 용액 15μl, 차가운 뉴클레아제가 없는 물 15μl를 추가하고, 짧게 혼합하고(와류가 발생하지 않음), 10초 동안 11,000 x g에서 샘플을 잠시 회전시킨 다음 cRNA가 침전될 수 있도록 최소 30분 동안 -20°C에서 보관합니다.
4. 원심분리기를 4°C로 예냉각하고 침전 후 13,000 x g에서 최소 15분 동안 원심분리기
5. 튜브 바닥의 옅은 갈색 펠릿에서 상층액을 조심스럽게 완전히 제거하고 -20 ° C로 냉각 된 150 μl의 70 % RNA 등급 에탄올을 첨가합니다. 4 ° C에서 13,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 사용합니다.
6. 상층액을 완전히 제거하고 실온에서 원심 증발기(예: Eppendorf Concentrator 모델 5301)에 남아 있는 cRNA pellet를 짧게(1-2분) 건조시킵니다.
7. 펠릿을 12μl의 차가운 뉴클레아제가 없는 물에 용해시킵니다. 주의: 모든 후속 단계는 cRNA 샘플이 얼음에 보관된 상태에서 수행해야 합니다.
8. 분광광도계(예: Eppendorf BioPhotometer)를 사용하여 cRNA 농도를 측정합니다.
9. 아가로스 겔 전기영동으로 cRNA의 무결성을 확인합니다. 주의: 부분적으로 분해된 RNA조차도 0이 아닌 UV 흡수를 생성하기 때문에 이러한 교차 확인이 필요합니다. cRNA 전기영동을 위해 TAE 완충액과 갓 준비된 1% 아가로스 겔로 새로 채워진 철저히 세척된 전기영동 챔버를 사용합니다. 전기영동 챔버 또는 완충액에서 RNAse 오염이 의심되는 경우, 세척을 위해 챔버를 0.1M HCl로 1시간 동안 채우고 뉴클레아제가 없는 물로 TAE 완충액을 준비합니다.
10. cRNA는 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.cRNA는 -20°C에서 최소 1년 동안 보관할 수 있습니다.

4. 부분 난소 절제술로 Xenopus laevis 암컷으로부터 난소 재료 채취

이 의정서는 담당 국가 기관(Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, 베를린 상원, 독일)의 승인을 받았습니다.

1. 구토를 방지하기 위해 수술 최소 12시간 전에는 개구리에게 먹이를 주지 마십시오.
2. 2mM HEPES 완충액으로 pH 7.0으로 조정 된 1L 물에 용해 된 국소 마취 트리카인 (MS-222) 2g의 용액을 준비합니다. 주의: MS-222를 취급하는 동안에는 항상 니트릴 장갑을 착용하고 화학 물질 안전 캐비닛에 용액을 준비하십시오.
3. 개구리가 더 이상 올바른 반사 신경을 보이지 않을 때까지 트리카인 용액에 개구리를 담그십시오(최대 10분). 무반응을 확인하려면 개구리를 등에 업고 손으로 뒤집어 방어 움직임을 관찰하십시오.
4. 트리카인 용액에서 개구리를 손으로 꺼내고 차가운 수돗물로 동물을 헹구어 마취제를 제거하십시오.
5. 얼음에 직접 닿아 개구리의 피부가 손상되지 않도록 젖은 종이 타월로 덮인 얼음 침대 위에 개구리를 등을 대고 놓습니다. 건조를 피하기 위해 작업 중에는 항상 동물의 피부를 젖은 상태로 유지하십시오. 얼음 위에 놓으면 마취 시간이 길어집니다.
6. 날카로운 가위로 개구리 정중선의 왼쪽이나 오른쪽에 작은 복부 절개(길이 8-10mm)를 만듭니다. 주의 : 측선이 다치지 않도록 주의하십시오. 후속 수술은 기저 난소 조직이 잘 회복될 수 있도록 교대로 해야 합니다. 일반적으로 세 개의 조직층(바깥쪽 피부, 얇은 흰색 결합 조직층인 근막, 근육층)을 관통해야 합니다.
7. 복부를 연 후 뭉툭한 집게로 난소엽의 일부를 잡고 바깥쪽으로 부드럽게 당깁니다. 지침으로, 절개를 통해 난소에서 약 3-5cm의 난소 물질을 제거합니다. 작은 혈관이 손상되어 출혈이 있는 경우 멸균 플라스틱 막대로 압력을 가하거나 출혈이 멈출 때까지 얼음으로 부상을 식히십시오.
8. 4.0 Ethicon Vicryl 봉합사(Johnson & Johnson #V633H)로 중단된 봉합 패턴을 사용하여 절개 부위를 외과적으로 봉합합니다. 봉합을 위해 수술 도구를 사용하고 절개 부위를 따라 2-3개의 매듭을 따로 묶습니다. 주의: 각 매듭이 한 단계에서 세 개의 조직층을 봉합하는 것이 중요합니다.
9. 수술 후 개구리를 약간 기울어진 물동이(30L)에 넣으면 바닥을 덮을 만큼의 물이 들어 있어 개구리의 콧구멍이 숨을 쉴 수 있을 만큼 수면 위에 있도록 합니다. 기상 시간(약 1-2시간) 동안 민감한 피부가 건조하지 않도록 젖은 종이 타월로 동물을 덮으십시오.
10. 개구리가 다시 활동할 때, 물통을 채우고 개구리를 다른 동물과 분리하여 3-4일 동안 보관하여 회복과 상처 치유를 모니터링합니다.
11. 수술 후 개구리와 난소 조직이 완전히 회복될 수 있도록 최소 3개월 동안 후속 수술로부터 개구리를 구하십시오. 지침으로 각 개구리에 대해 최대 6-8회의 수술을 수행할 수 있습니다.

5. 개별 난모세포의 효소 분리

1. 난소 물질을 가위로 더 작은 조각으로 자르고 조직을 콜라겐 분해 효소(20mg/ml, 클로스트리듐 히스톨리티쿰의 1A형, Sigma #C9891) 및 트립신 억제제(10mg/ml, 닭 달걀 흰자위의 III-O형, 시그마 #T2011).
2. 18°C에서 2.5시간 동안 분해액을 부드럽게 흔듭니다. 그 후, 대부분의 난모세포가 난포 조직에서 분리될 때까지 15분 간격으로 분해 진행 상황을 따릅니다.
3. 용액이 조직 파편에서 충분히 제거될 때까지 Ca²⁺가 없는 난모세포 링거 용액이 있는 50ml 팔콘 튜브에서 난모세포를 여러 번 세척합니다.
4. 겐타마이신(50μg/ml)을 포함한 Ca 2+(110mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 5mM HEPES, pH 7.4)를 함유한 난모세포 링거 용액에 난모세포를 18°C에서 보관합니다.

6. cRNA 주입

1. Na⁺,K⁺- 또는 H⁺,K⁺-ATPase의 발현을 위해 3.5" 헤마토크릿 튜브(Drummond #3 000-203-G/X)가 있는 전기 구동 Nanoject II 주입 펌프(Drummond Scientific Inc.)를 사용하여 25ng α-subunit 및 5ng β-subunit cRNA를 포함하는 50 nl cRNA 용액을 난모세포에 주입합니다. 주의: mRNA의 양은 표적 단백질에 따라 달라질 수 있으며 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의한 최대 발현을 위해 조정해야 할 수도 있습니다.
2. 각 플럭스 조건(예: 특정 Rb⁺ 농도)에 대해 18-22개의 난모세포를 주입합니다. 이 중 50%는 "+플럭스" 조건(예: 특정 Rb⁺ 농도)에서, 50%는 "-플럭스" 조건(예: 선택한 Rb⁺ 농도 및 포화 농도의 효소 특정 억제제, 예: Na⁺,K⁺-ATPase의 경우 10mM ouabain 또는 H⁺,K⁺-ATPase의 경우 pH 5.5에서 10μM SCH28080)에서 분석됩니다.
3. 주입 후, 18°C에서 Ca²⁺ 및 50μg/ml 겐타마이신을 함유한 난모세포 링거 용액으로 반쯤 채워진 96웰 플레이트에 난모세포를 별도로 이동합니다.
4. 과도한 증발을 방지하기 위해 96웰 플레이트를 파라필름으로 덮습니다.
5. 난모세포를 18°C에서 2-7일(관심 단백질에 따라 다름) 동안 배양합니다. 3일 이상 난모세포 보관이 필요한 경우 3일마다 마이크로웰 내의 배양 완충액을 교환하는 것이 좋습니다.
6. 각 플럭스 데이터 세트(예: [Rb⁺] 적정 실험)에 대해 약 10개의 비주입(또는 50nl 뉴클레아제가 없는 물 주입) 제어 난모세포를 "+flux" 및 "-flux" 조건에서 분석해야 합니다. 따라서 플럭스 분석 전에 cRNA 주입된 난모세포와 동일한 방식으로 충분한 수의 대조 세포를 배양합니다.

이종 ATPase 발현 난모세포의 전처리

Na⁺ 로딩 절차

Na⁺/K⁺-ATPase의 기능 측정을 위해서는 다음과 같이 세포 내 Na⁺ 농도¹³을 높이는 것이 중요합니다.

1. 얼음 위에서 45분 동안 난모세포를 Na⁺ 로딩 버퍼(110mM NaCl, 2.5mM Na-구연산염, 2.5mM MOPS, 2.5mM TRIS, pH 7.4)로 전달합니다.
2. 후속 복구를 위해 Post Loading Buffer "PLB"(100mM NaCl, 1mM CaCl₂, 5mM BaCl₂, 5mM NiCl₂ 및 2.5mM MOPS, 2.5mM TRIS, pH 7.4)에서 얼음에서 최소 30분 동안 난모세포를 배양합니다.
3. 사용할 때까지 PLB의 얼음에 난모세포를 보관하십시오.

7. 내인성 Na⁺,K⁺-ATPase의 사전 차단

주의: Xenopus 난모세포는 내인성 Na⁺,K⁺-ATPase를 발현하기 때문에 다음과 같이 Rb⁺ 플럭스 실험 전에 이 내인성 펌프를 차단하는 것이 중요합니다.

1. 이제 실온에서 15분 동안 100μM 와바인을 함유한 Post Loading Buffer에서 난모세포를 배양하여 내인성 Na⁺,K⁺-ATPase를 차단합니다.

8. 전기생리학

1. 2단계 마이크로피펫 풀러(Model PC-10, Narishige)를 사용하여 붕규산 모세관(GB150F-8P, Science Products GmbH)을 당겨 미세전극을 준비합니다.
2. 뒤쪽의 유리 전극을 3M KCl로 채웁니다. H⁺,K⁺-ATPase를 사용한 TEVC 실험의 경우 보다 안정적인 전류 기록으로 이어지는 3M NaCl을 대신 사용하는 것이 좋습니다. 2전극 전압 클램프 설정의 미세 전극 홀더의 Ag/AgCl 와이어 위에 피펫을 장착합니다.
3. Ag/AgCl 기준 전극을 수조 용액에 연결하는 유리 미세 전극과 두 개의 한천 브리지(일반적으로 사용되는 KCl/한천 대신 NaCl/한천으로 만들어야 함)를 측정 버퍼(예: Na⁺,K⁺-ATPase의 경우 10μM 와바인이 있는 PLB)가 미리 채워진 기록 챔버(Warner Instr., 모델 RC-10)에 삽입합니다.
4. 볼륨을tage-clamp ampliifier(Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Germany)를 "OFF" 모드로 전환합니다.
5. 각 유리 전극의 저항을 개별적으로 확인하십시오(둘 다 0.5-2MΩ 범위에 있어야 함).
6. vol의 오프셋 전위를 확인하십시오.tage 및 현재 전극은 적절한 TEVC 증폭기 디스플레이에서 확인할 수 있습니다. 0과의 불일치가 있는 경우 증폭기의 해당 오프셋 레귤레이터로 오프셋을 조정하십시오.
7. 챔버 중앙에 난모세포를 놓고 전류와 전압 전극으로 멤브레인을 부드럽게 관통합니다.
8. 의 전위 판독값을 확인하십시오 amp리퍼. 전압 전극의 전위에 대한 판독값은 이제 셀의 휴지 전위에 대한 값을 제공합니다.
9. 스위치 ampliifier를 VC(voltage-clamp) 모드로.
10. pCLAMP 소프트웨어(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)를 사용하여 세포를 사전 정의된 멤브레인 전위로 고정합니다. 이는 이전에 측정된 휴지 전위의 값(제로 멤브레인 전류 조건에서 기록하기 위해) 또는 원하는 테스트 전위 값일 수 있습니다. 누설 전류의 진폭과 안정성(K⁺/Rb⁺/Li⁺가 없는 경우)에 주의해야 하며, 이는 일반적인 지침으로 -30mV에서 -200nA를 초과해서는 안 됩니다.
11. Rb⁺ 함유 용액으로 특정 시간(예: Na⁺,K⁺-ATPase의 경우 3분) 동안 난모세포를 관류하고(클램핑되지 않은 조건에서 플럭스 측정에서 포화 농도를 사용하여 최대 전류 사용을 달성하기 위해) 연속 기록 모드에서 pCLAMP 소프트웨어를 사용하여 펌프 전류를 기록합니다. 이후 30초 동안 Rb⁺-free 용액으로 셀을 관류하여 Rb⁺ 흡수가 완전히 중지되었는지 확인합니다.
    1. 2전극 전압 클램프 실험을 중지하고 기록 챔버에서 난모세포를 제거한 다음 "Rb⁺ 흡수 실험" 단락의 세척 단계 4로 진행하여 원자 흡수 분광 광도법으로 Rb⁺ 흡수를 분석합니다.
12. 오프셋 전류 감산을 수행하고 pCLAMP 패키지의 Clampfit 프로그램을 사용하여 펌프 전류의 시간 적분을 평가합니다.

9. Rb⁺ 흡수 측정

1. 200 μl 피펫의 노란색 피펫 팁을 약 2mm 직경으로 자르고 녹입니다. 이러한 팁을 사용하면 난모세포가 배양 또는 설거지 간에 이동할 때 용액의 전달을 최소화할 수 있습니다. 포켓 라이터의 불꽃으로 팁을 짧게 녹입니다. 이 연마 단계는 난모세포 손상을 방지합니다.
2. 각 난모세포를 측정할 수 있도록 1.5ml Eppendorf 튜브에 Millipore 물 1ml를 채웁니다. Rb⁺가 없는 세척액(예: PLB)이 있는 페트리 접시 3개와 Millipore 물이 있는 접시 하나를 배열합니다.
3. 5개의 사전 배양된 난모세포를 Rb⁺ 플럭스 완충액(0 - 15mM Rb⁺의 농도)으로 채워진 3.5cm 페트리 접시에 동시에 옮기고 온도 제어(예: 에어컨이 설치된 실내 또는 가열판에서 21°C)로 3분(Na⁺,K⁺-ATPase) 또는 15분(H⁺,K⁺-ATPase) 동안 배양합니다.
4. Rb⁺-free 세척 버퍼가 있는 첫 번째 접시에 난모세포를 동시에 전달합니다(Na⁺, K⁺-ATPase PLB의 경우 사용할 수 있음). 배양 시간 사이의 편차를 5초 미만으로 유지하는 것이 필수입니다. 부드럽게 헹굽니다.
5. Rb⁺가 없는 세척 버퍼가 있는 두 번째와 세 번째 접시에 난모세포를 넣고 부드럽게 헹굽니다.
6. Millipore 물과 함께 난모세포를 접시에 옮기고 부드럽게 헹굽니다.
7. 각 난모세포를 1ml의 Millipore 물을 채운 준비된 Eppendorf tube 중 하나에 개별적으로 옮깁니다.
8. 용액이 균일하게 탁해질 때까지 200 μl 피펫 팁으로 위아래로 피펫팅하여 난모세포를 균질화합니다.

10. THGA 용광로 시스템을 활용한 AAnalyst 800 준비

1. 필요한 불활성 가스(아르곤)의 밸브를 켜고 적절한 중공 음극 램프(Li⁺ 또는 Rb⁺용 단일 원소 HCL; Photron, Melbourne, Australia)를 임의의 소켓 위치에 놓습니다.
2. WinLab32 제어 소프트웨어(Perkin Elmer)를 시작하고 적절한 중공 음극 램프를 켭니다. Perkin Elmer Lumina 중공 음극 램프는 자동으로 인식되어 선택 목록에 나타납니다. 호환되지 않는 중공 음극 램프는 수동으로 입력해야 합니다.
3. l의 평형을 위해 약 10-15분의 예열 시간을 허용합니다.amps.
4. 육안 검사를 통해 THGA 튜브(가로로 가열된 흑연 분무기 튜브, Perkin Elmer, #B3000641)가 양호한 상태인지 확인하십시오. THGA 용광로는 300발(제조업체가 명시한 평균 수명)마다 교체해야 하지만 더 많은 샘플 수를 견딜 수 있습니다.
5. WinLab32에서 "THGA furnace" 기술을 선택합니다.
6. 10 - 50 μg/L 사이의 Rb⁺/Li⁺ 농도(예: 1 M RbCl 또는 LiCl 용액에서 적절한 희석)로 최소 5개의 보정 샘플을 준비하고 Millipore 물만 사용하여 1개의 blank probe를 준비합니다. 참고: 염은 사용 가능한 순도가 가장 높아야 합니다("puriss." 또는 AAS 목적을 위해 상업적으로 이용 가능한 교정 표준).
7. 적절한 초기화 파일(보정 매개변수에 대한 참조를 제공하고 AAS 검출 파장, Rb⁺ 및 Li⁺의 파장은 각각 780nm 및 670.8nm임)을 로드하는 "Method" 파일이라고 함)을 선택한 다음 보정 샘플의 위치와 농도를 입력합니다. 이를 위해 적절한 자동 시료 주입기(AAnalyst 800 장치의 경우 88 또는 148 시료 주입 위치가 있는 시료 트레이)를 선택합니다.
8. 보정 곡선을 측정합니다.
9. 이제 각 난모세포 균질액을 개별 1.2ml 폴리프로필렌 샘플 컵(Perkin Elmer, #B0510397)으로 옮기고 이 시험관을 오토샘플러 트레이에 넣습니다.
10. 자동 시료 주입기 위치에서 프로브를 식별하기 위한 시료 정보 파일을 생성한 다음 시료량을 20μl로 조정하고 기기를 시작합니다.
11. 실행 완료 후(또는 긴 일련의 샘플에 대해 매시간 육안 검사 중) 측정된 Rb⁺의 양이 보정 곡선의 최대값을 초과하는 프로브를 확인합니다. 그렇다면 각 샘플을 적절하게 희석하고 다시 측정하십시오.

11. 큰 표본 수(50 이상) 측정에 대한 설명

• 기기를 밤새 실행하려면 시험관에서 균질액이 증발하는 것을 방지하기 위해 오토샘플러의 저장소를 Millipore 물로 채우는 것이 좋습니다.
• 자동 시료 주입기의 주입 모세관이 막히는 것을 방지하기 위해 각 20개의 시료 사이에 2% HNO₃가 있는 테스트 튜브를 배치하는 것이 좋습니다.

루비듐에 권장되는 THGA-AAS 온도 프로토콜

<테이블 테두리="1"> 걸음 온도(°C) 램프 시간(초) 보류 시간(초) 아르곤 가스 유량(ml/min) 건조 1 110의 1 개 20분 250명 건조 2 130의 5 개 30분 250명 열분해 300-600년 10분 20분 250명 원자화 1700-1800년 0 5 개 0 정리 2400년 1 개 2 개 250명

리튬에 권장되는 THGA-AAS 온도 프로토콜

<테이블 테두리="1"> 걸음 온도(°C) 램프 시간(초) 보류 시간(초) 아르곤 가스 유량(ml/min) 건조 1 110의 1 개 30분 250명 건조 2 130의 15분 30분 250명 열분해 900명 10분 20분 250명 원자화 2200년 0 5 개 0 정리 2450년 1 개 3 250명

데이터 분석

1. 각 측정 조건에 대해 평균 Rb⁺ 흡수를 계산합니다. AAS 분광 광도계는 μg/L 단위의 값을 산출하며, 이 값은 pmol/oocyte/min으로 변환해야 합니다.
2. 역학 분석(겉보기 KM 값)의 경우, 주어진 RbCl 농도에서 동일한 배치의 주입되지 않은 대조 난모세포에서 결정된 백그라운드 Rb⁺ 흡수를 뺍니다.
3. Origin 소프트웨어로 플롯하고 Hill 또는 Michaelis-Menten function 의 핏을 데이터에 적용합니다. 이 방정식에서 [S]는 기판 농도, nH는 Hill 계수, K_0.5는 절반 최대 활성화에 필요한 기판 농도입니다.

Xenopus 난모세포 발현 시스템에서 AAS에 의한 K+-(또는 Rb+) 역수송 P형 ATPase에 의한 Rb+ 흡수의 정량화는 효소 동역학 매개변수의 신뢰할 수 있는 측정을 가능하게 합니다.

Na+/K+-ATPase의 수송 화학량론 결정

전기적 Na+/K+-ATPase의 경우, Rb+ 플럭스는 순 전하 전송(펌프 전류의 시간 적분)과 Rb + 전송 사이의 상관 관계를 목표로 하는 2전극 전압 클램프 실험에서 결정할 수 있습니다. 그림 1A는 1mM Rb+를 함유하는 용액으로 Na+,K+-ATPase 발현 난모세포의 관류에 의해 유도된 펌프 전류(약 40nA 정상 전류 진폭)의 기록을 보여줍니다. 전류 신호(현재 트레이스 아래의 회색 음영 영역)를 통합하면 총 수송 전하가 7839nC(전하 0.0822nmol에 해당)가 산출되었습니다. 동일한 난모세포를 AAS 측정법에 따라 후속 분석했을 때 총 0.176 nmol의 Rb+가 발견되었습니다. 총 전하와 Rb+ 플럭스 사이의 비율은 0.47이었으며, 이는 Na+,K+-ATPase의 3:2 Na+/K+(Rb+) 수송 화학량론에서 예상되는 값인 0.5에 가깝습니다(하나의 기본 전하의 순 외측 수송은 두 개의 Rb+/K+ 이온의 흡수에 해당). 이러한 단일 세포 실험을 여러 번 반복하면(그림 1B) 총 전하와 Rb+ 수송 사이에 0.49의 기울기 계수로 양호한 선형 상관 관계가 생성됩니다. 따라서 단일 세포 수준에서도 AAS 기술은 매우 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

H+/K+-ATPase 분석을 위한

Rb+ 플럭스 실험

전기중립으로 작동하는 H+/K+-ATPase의 경우 Rb+ 흡수의 [Rb+] 의존성과 특정 억제제 SCH28080에 대한 민감도를 결정할 수 있습니다. 표 1에 열거된 데이터는 서로 다른 난모세포 배치에 대한 3가지 실험 세트에서 획득되었으며, H+,K+-ATPase에 의해 매개되는 Rb+ 플럭스(15분 플럭스 시간)는 서로 다른 외부 Rb+ 농도에 대해 pHex 5.5의 Na+-free 완충액에서 측정되었습니다. 주입되지 않은 난모세포로의 비특이적 흡수는 최대로 검출된 Rb+ 흡수량의 10% 미만이며, 이는 SCH28080 첨가에 둔감한 반면, H+,K+-ATPase 발현 난모세포의 플럭스는 10μM SCH28080 첨가 시 백그라운드 수준으로 감소합니다(pHex 5.5에서). (주입되지 않은 난모세포로부터의) 비특이적 Rb+ 흡수를 빼면 그림 2와 같은 데이터가 생성됩니다. 그림 2의 검은색 사각형은 표 1의 데이터를 나타내는 반면, 열린 사각형은 Na+ 함유 버퍼에서 Rb+ 플럭스를 측정한 유사한 실험 세트에서 획득했습니다. 이러한 데이터는 (1) Rb+에 대한 H+,K+-ATPase turnover 수송의 겉보기 친화도에 대한 값, (2) 겉보기 친화도가 세포 외 Na+에 의해 어떻게 수정되는지를 산출하며, 이는 세포 외 Na+ 이온이 수송 중에 세포 외를 향하는 양이온 결합 포켓을 놓고 경쟁하여 Rb+ 4에 대한 겉보기 친화력의 감소로 이어진다는 것을 보여줍니다.

TEVC 및 AAS 결정에 의한 막 전위 제어 하에서 Rb+ 흡수 실험의 조합은 다양한 pH 조건에서 H+/K+(Rb+) 회전율 수송의 전압 의존성을 결정하기 위해 적용될 수도 있습니다. 이러한 결합 실험에서 비롯된 데이터는 표 2에 나열되어 있으며, H+,K+-ATPase에 의한 Rb+ 수송은 멤브레인 전압을 약 -10mV에서 -100mV로 변경해도 약하게 영향을 받는다는 것을 보여줍니다. 또한, 표 2의 데이터는 H+,K+-ATPase에 의한 Rb+ 수송이 pHex 7.4에 비해 pHex 5.5에서 약 2배 정도 자극됨을 보여준다. 언뜻 보기에 이 결과는 직관적이지 않은데, 세포 외 H+ 농도의 증가는 효소가 더 가파른 H+ 구배에 대해 펌핑해야 하기 때문에 오히려 회전율 감소로 이어지기 때문입니다. 그러나, 추가 실험에 의해 세포질 pH를 약 0.5 단위 정도 조절된 감소가 세포 외 pH7에 관계없이 수송에 동일한 자극 효과를 가진다는 것을 보여줄 수 있습니다. 이러한 자극은 pHex 5.57의 용액에서 배양 시 난모세포 내부의 약간의 산성화 때문입니다. 표 2에서 도출할 추가 정보는 10μM SCH28080 억제제의 첨가가 pHex 7.4 및 5.5에서 상이한 수준의 억제를 유발한다는 것입니다. 이것은 양성자화된 형태의 SCH28080만이 약리학적으로 활성화되기 때문입니다. pHex 5.5에서 화합물의 50%는 양성자화된 활성 형태인 반면, pHex 7.4에서는 1%에 불과하여 훨씬 약한 억제7로 이어집니다.

H+/K+-ATPase 돌연변이의 기능적 효과를 조사하기 위한

Rb+ 플럭스 실험

AAS 검출 기술의 성취 잠재력에 대한 또 다른 예가 그림 3에 나와 있습니다. 그림 3A는 H+,K+-ATPase α-subunit의 C-말단에서 1개(ΔY), 2개(ΔYY) 또는 5개(ΔQELYY)의 아미노산이 삭제된 여러 H+,K+-ATPase 구성에 대한 Rb+ 플럭스를 비교합니다. Na+,K+-ATPase의 경우, C-말단은 양이온 결합 부위 14-16의 구조적 안정화에 중요한 별개의 구조 요소인 것으로 나타났습니다. 2개의 C-말단 Tyr 잔기(ΔYY) 또는 마지막 5개의 아미노산(ΔKETYY)의 결실은 양이온 수송의 전압 의존 매개변수에 큰 영향을 미쳤고 세포 외 K+ 17-19가 없는 상태에서 H+- 및 Na+ 자극 정지 내부 전류의 발생으로 이어졌습니다. C-말단 절단이 H+,K+-ATPase에 의한 양이온 수송에도 영향을 미치는지 여부를 밝히기 위해 그림 3A와 같이 H+,K+-ATPase 야생형 및 C-말단 절단 구조체의 Rb+ 수송 활성을 분석했습니다. 이러한 데이터는 Rb+ 흡수 활성이 C-말단 결실 정도에 따라 점차 감소한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, WT 효소에 대해 높은 10μM SCH28080에 의한 Rb+ 흡수 억제의 정도는 ΔY 작제물에 대해 매우 감소하고 ΔYY 및 ΔQELYY 작제물에 대해서는 본질적으로 존재하지 않습니다. 이 시점에서, 특정 Rb+ 흡수 활성의 감소가 수송 회전율에 대한 돌연변이의 특징적인 영향 때문이라고 직접 결론을 내릴 수는 없는데, 이는 단백질 접힘, 안정성 또는 원형질막 표적화에 대한 일반적인 영향과 같은 다른 설명도 고려해야 하기 때문입니다. 측정된 Rb+ 플럭스를 원형질막의 H+,K+-ATPase 단백질의 양과 연관시키기 위해 그림 3A의 구조체를 발현하는 난모세포에서 원형질막(PM) 분획 및 총 세포막 분획(TM)을 준비하고 샘플을 SDS-PAGE(https://www.jove.com/video/758/electrophoretic-separation-of-proteins)20 및 H+,K+-ATPase α-subunit에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅. 이 원형질막 정제 절차는 Kamsteeg와 Deen21에 의해 처음 설명되었으며 나중에4,22에서 일부 수정되었습니다. 아래 패널의 그림 3B는 TM 분획 내 총 H+,K+-ATPase α-subunit 단백질의 상대적 양이 조사된 모든 H+,K+-ATPase 구성에 대해 매우 유사하다는 것을 보여줍니다. 그러나 PM 분획(그림 3B 상단 패널)에서 단백질의 상대적 양은 C-말단 결실의 범위가 증가함에 따라 점차 감소합니다. 따라서 이러한 실험 조합을 통해 H+,K+-ATPase의 α-subunit의 C-terminus의 절단이 원형질막 발현에 영향을 미친다는 결론을 내릴 수 있으며, 이는 α-subunit의 접힘 및 구조적 안정성 또는 β-subunit과의 연관성이 절단의 영향을 받을 수 있음을 나타냅니다. 이는 특정 Rb+ 흡수의 감소에 대한 설명으로도 사용됩니다. 그러나 SCH28080 억제 데이터는 절단 구문에 대한 추가 정보를 제공합니다. SCH28080 억제제는 촉매 주기의 특정 구조적 하위 상태, 즉 양이온 결합 부위가 세포외액을 향하고 Rb+/K+에 대한 친화력이 높은 소위 E2(P) 형태(P는 인산화 중간체를 나타냄)를 표적으로 합니다. Rb+ 흡수 실험에서 C 말단이 절단된 양성자 펌프의 감도가 10μM SCH28080로 크게 감소한 경우(그림 3A의 검은색 막대)는 반응 주기 중간체의 정상 상태 분포가 양이온 결합 포켓이 세포 내 매질에 노출되는 E1(P)와 같은 구조적 하위 상태로 이동함을 시사합니다4. 이러한 데이터는 또한 심오한 기계론적 결론을 원하는 경우 기능적 데이터와 생화학적 데이터를 연관시키는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다.

Rb+ 플럭스의 온도 의존성

Rb+ 플럭스는 활성화 에너지와 같은 열역학적 매개변수를 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이, H+,K+-ATPase를 발현하는 난모세포에 의한 Rb+ 흡수는 온도에 크게 의존합니다. 특히, Rb+ 흡수 중 34°C 배양 온도에서도 비특이적 Rb+ 흡수는 여전히 낮으며, 이는 SCH28080 억제제가 존재하는 34°C에서 플럭스의 낮은 값에서 알 수 있습니다. 역수 온도에 대한 Rb+ 흡수의 데카딕 로그(Arrhenius 플롯)를 플로팅하면 데이터의 우수한 선형 상관 관계가 생성되어 곡선의 기울기에서 96kJ/mol의 활성화 에너지가 생성되며, 이는 효소 촉매 반응에 일반적이며 Na+의 펌프 전류에 대해 결정된 값과도 잘 일치합니다. Xenopus 난모세포 발현 시스템에서 측정된 K+-ATPase1.

Li+ 흡수 측정

Rb+ 외에도 H+,K+-ATPase에 의한 Li+ 흡수는 AAS 기술에 의해 민감하게 결정될 수 있습니다. 그림 5는 주입되지 않은 난모세포에서 비특이적 Li+ 흡수가 매우 낮고, Li+ 농도가 최대 60mM까지 증가함에 따라 H+,K+-ATPase 발현 난모세포에 대한 흡수가 증가한다는 것을 보여줍니다. 이는 Rb+의 경우 다르며, Rb+ 흡수의 포화 상태는 이미 5mM 이상의 농도에서 관찰됩니다. 특히 Li+ 흡수 활성은 Rb+ 흡수 활성보다 큽니다. 또한 10μM SCH28080는 Li+ 흡수를 거의 감소시키지 않는 반면(억제제가 있는 경우와 없는 경우 30mM Li+의 막대 비교), Rb+의 경우 억제가 더 강합니다. 특히, 이 실험은 pHex 7.4에서 수행되었으며, 여기서 SCH28080 화합물의 작은 부분만이 활성(양성자화) 형태입니다. 따라서 Li+는 정지 H+/Li+ 턴오버 사이클링 동안 E1(P) 상태7에 대한 효소의 선호를 유도하는 측면에서도 작용할 수 있습니다.

<테이블 테두리="1"> [Rb +] / mM 정규화된 Rb+ 플럭스 억제제 없음 + 10 μM SCH28080 5(주입되지 않은 난모세포) 0.07 ± 0.01 0.074 ± 0.002 0.05 호 0.17 ± 0.01 0.05 ± 0.02 0.1 0.31 ± 0.01 0.05 ±0.03 0.25 호 0.50 ± 0.03 0.05 ± 0.03 0.5 0.64 ± 0.03 0.07 ± 0.04 1 개 0.80 ± 0.03 0.08 ± 0.05 2.5 호 0.83 ± 0.06 0.15 ± 0.05 5 개 1.00 ± 0.05 0.13 ± 0.04 정규화 값: 3개의 개별 실험에서 평균 Rb+-플럭스(5mM Rb+에서), 29.2pmol/난모세포/분(각 실험의 데이터 포인트당 10-15개의 난모세포)

표 1. HKα-S806C/HKβ를 발현하는 난모세포에 의한 Rb+ 흡수의 SCH28080 민감도. Rb+ 흡수는 10μM SCH28080의 부재 또는 존재 하에서 상이한 Rb+ 농도를 함유하는 세포외 Na+-free 용액에서 pH 5.5에서 측정되었습니다. 데이터는 5mM[Rb+]에서 Rb+ 흡수로 정규화되었으며 단일 배치에서 10-15개의 난모세포에서 평균 ± S.E.M.으로 제공됩니다.

<테이블 테두리="1">   pHex7.4 (pmol/ooc./min 단위) pHex 5.5 (pmol/ooc./min 단위) VM = -100mV 11.9 ± 1.1 24.5 ± 1.3 비클램프(-10...-20 mV) 13.9 ± 1.5 26.5 ± 1.2 제어: pHex 5.5, -100 mV + 10 μM SCH28080 2.4 ± 0.8

표 2. HKα-S806C/HKβ를 발현하는 난모세포에 의한 Rb+ 흡수의 전압 의존성. 값은 HKαS806C/βWT를 발현하는 난모세포에 대해 5mM Rb+ 및 pHex 7.4 또는 5.5에서 Rb+ 흡수(pmol/난모세포/min)를 나타내며, 이는 2전극 전압 클램핑에 의해 -100mV에서 유지되거나 전압 제어 없이 Rb+ 흡수를 적용되었습니다("휴지" 막 전위는 10 및 -20mV, 독립적으로 결정됨). 데이터는 한 세포 배치(N=12...23)의 난모세포에서 얻은 S.D.± 평균입니다.

그림 1. 2전극 전압 클램프(TEVC) 실험에서 Na+,K+-ATPase와 펌프 전류에 의한 Rb+ 흡수의 상관관계. (A) 와바인 내성 인간 Na+,K+-ATPase α2/β 1-subunit 복합체를 발현하는 난모세포에서 측정된 -10mV 멤브레인 전위에서 정지 펌프 전류 기록. 펌프 전류는 Rb+-free에서 1mM Rb+ 함유 용액(각각 전류 트레이스 위의 흰색 및 부화한 막대)으로의 용액 교환에 의해 시작되었습니다. 전류의 시간 적분(여기서는 7840nC)은 0.082nmol의 기본 전하의 순 외부 전송에 해당합니다. 측정된 난모세포를 기록실에서 제거하고 AAS 절차를 진행했을 때 세포에서 총 0.176nmol Rb+가 발견되었으며, 이는 수송된 전하량의 약 2.1배입니다. (B) 단일 난모세포에 대한 2전극 전압 클램프 Rb+ 플럭스 실험에서 측정된 총 수송 전하(펌프 전류의 시간 적분)와 AAS에 의해 이후에 측정된 셀당 Rb+의 양 사이의 상관관계. 그래프는 단일 셀에서도 전하와 Rb+ 흡수 사이의 양호한 선형 상관관계(감소된χ2 및 상관 계수 R2 값 참조)를 얻을 수 있음을 나타냅니다. 데이터에 대한 선형 적합도(0.49 ± 0.10)에서 파생된 기울기 계수는 Na+,K+-ATPase의 3Na+/2K+(Rb+) 수송 화학량론과 일치하여 수송된 전하당 2Rb+ 이온의 흡수와 일치합니다.

그림 2. H+,K+-ATPase에 의한 농도 의존적 Rb+ 흡수. pH 5.5에서 세포 외 Na+의 부재(채워진 사각형) 또는 존재(열린 사각형)에서 정규화된 Rb+ 흡수가 표시됩니다. 난모세포는 HKα-S806C 돌연변이 및 HKβ-subunit에 대한 cRNA를 주입했습니다. 데이터는 다음 값으로 사용된 최대 RbCl 농도에서 Rb+ 흡수로 정규화되었습니다(pmol/난모세포/최소: Na+가 없는 경우 29.3, 27.4, 30.8, Na+가 있는 경우 21.1, 23.4). 데이터는 S.E.M.± 평균으로, 3개의 실험에서 8-12개의 난모세포에서 추출됩니다. 겉보기 반최대 활성화 상수 K0.5는 Michaelis-Menten 함수를 데이터에 적합하여 얻었습니다(각각 점선과 점선으로 표시된 맞춤 곡선

).

그림 3. C-말단이 잘린 H+,K+-ATPase 구조체에 의한 Rb+ 흡수. (A) 10μM SCH28080의 부재(부화 막대) 또는 존재(검은색 막대)에서 5mM RbCl에서 H+,K+-ATPase 매개 Rb+ 흡수. 주입되지 않은 대조군 난모세포, HKβ-subunit의 cRNA가 주입된 난모세포 및 표시된 C-말단 절단이 있는 HKα-S806C 또는 HKα-구조체의 결과가 표시됩니다. 데이터는 15-20개의 난모세포를 사용한 3번의 개별 실험에서 얻은 ±S.E.M.의 평균으로, HKα-S806C/HKβ의 Rb+ 흡수(각각 20.4, 23.7 및 29.5 pmol/난모세포/분에 해당)로 정규화되었습니다. (B) H+,K+-ATPase 발현 난모세포에서 분리된 원형질막(PM, 상부 패널) 및 총 막분율(TM, 하부 패널)의 웨스턴 블롯 분석. 검출은 항-HKα-서브유닛 항체 HK12.18을 사용했다23. 서로 다른 난모세포 배치에서 나온 최소 3개의 서양 블롯 중 하나의 대표적인 웨스턴 블롯이 표시되어 있습니다.

그림 4. 위 H,K-ATPase에 의한 Rb+ 흡수의 온도 의존성. (A) 표시된 바와 같이 18 및 34 ° C 사이의 온도에서 5 mM Rb+ 및 pHex 5.5 (밝은 회색 막대)에서 H +, K + - ATPase 매개 Rb+ 흡수 (pmol / oocyte / min). 흰색 막대는 동일한 조건의 각 온도에서 주입되지 않은 제어 난모세포의 Rb+ 흡수를 나타냅니다. 34°C의 회색 막대는 10μM SCH28080억제제가 있는 상태에서 pHex 5.5에서 Rb+ 흡수를 나타냅니다. 각 열의 데이터는 한 세포 배치의 난모세포에서 20-25개의 난모세포를 가진 평균입니다. (B) Arrhenius 다이어그램 (A)의 데이터에서 온도 의존적 Rb+ 흡수에 대한 Rb+ 흡수 대 역수 로그의 그래프). 각 데이터 포인트는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± S.E.M.으로 제공됩니다. 정규화를 위해 각 실험에 대해 34°C에서 Rb+ 흡수를 취했습니다. 데이터(점선)에 직선이 맞음으로써 얻어지는 활성화 에너지는 약 96kJ/mol입니다.

그림 5. H+,K+-ATPase에 의한 Li+ 및 Rb+ 흡수 비교. H+,K+-ATP표시된 LiCl 농도에서 Li+의 흡수 및 5mM RbCl에서 Rb+의 흡수. 세포외 pH는 7.4였습니다. 주입되지 않은 대조군 난모세포와 특정 [Li+] 또는 [Rb+] 및 10μM 억제제 SCH28080이 존재하는 상태에서 H+,K+-ATPase를 발현하는 난모세포의 결과도 포함됩니다. 데이터는 단일 배치의 8-15개 난모세포에서 S.E.M.± 평균입니다.

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.