우리는 Xenopus 난모세포에서 효소의 이종 발현을 통해 K+-역수송 P형 ATPase의 활성을 정량화하고 원자 흡수 분광 광도법으로 개별 세포로의 Rb+ 또는 Li+ 흡수를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소 플럭스 실험에 대한 민감하고 안전한 대안으로 복잡한 동역학 연구를 용이하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전기막 수송체 Na+,K+-ATPase에 의한 양이온 수송은 전기생리학으로 측정할 수 있는 반면, 전기중립으로 작동하는 위 H+,K+-ATPase는 조사하기가 더 어렵습니다. 많은 수송 분석은 충분한 신호 대 잡음 비율을 달성하기 위해 방사성 동위원소를 사용하지만, 필요한 보안 조치는 인체 노출 또는 분석 설계와 관련하여 엄격한 제한을 가합니다. 또한, 세포막을 통한 이온 수송은 막 전위에 의해 결정적인 영향을 받는데, 이는 세포 배양 또는 프로테오리포좀 제제에서 직접적으로 제어되지 않습니다. 여기에서는 미량의 화학 원소에 대한 원자 흡수 분광 광도법(AAS)의 뛰어난 감도를 활용하여 단일 세포에서 Na+,K+- 또는 위 H+,K+-ATPase에 의한 Rb+ 또는 Li+ 수송을 측정합니다. Xenopus 난모세포를 발현 시스템으로 사용하여 자동 시료 주입기에서 로드된 횡가열 흑연 분무기(THGA) 용광로가 장착된 AAS 장치에서 단일 난모세포 균질액 샘플을 측정하여 세포로 운반되는 Rb+(Li+)의 양을 측정합니다. 대조 난모세포로 또는 ATPase 특이적 억제제 적용 중 비특이적 Rb+ 흡수의 배경이 매우 작기 때문에 많은 수의 실험 조건을 동시에 포함하는 복잡한 동역학 분석 계획을 구현하거나 부위 특이적 돌연변이 수송체의 수송 용량과 동역학을 높은 정밀도로 비교할 수 있습니다. 또한, 양이온 흡수는 단일 셀에서 측정되기 때문에 플럭스 실험을 TEVC(two-electrode voltage-clamping)와 함께 수행하여 멤브레인 전위와 전류를 정확하게 제어할 수 있습니다. 이를 통해 예를 들어 Na+,K+-ATPase의 3Na+/2K+ 수송 화학량론을 정량적으로 결정할 수 있었고 전기 중성으로 작동하는 위 H+,K+-ATPase에 의한 양이온 수송의 전압 의존성을 처음으로 조사할 수 있었습니다. 원칙적으로 이 분석은 K+ 수송 막 단백질에 국한되지 않지만, 중금속 또는 전이 금속 수송체의 활성 또는 세포내 과정에 의한 화학 원소 흡수를 처리하는 데에도 동일하게 효과적일 수 있습니다.
서론
우리는 동위원소 실험실에 대한 접근, 안전 요구 사항 또는 리튬의 경우와 같이 매우 짧은 붕괴 시간으로 인해 사용할 수 없을 수도 있는 값비싼 방사성 동위원소의 사용과 관련된 제한을 피하기 위해 이온 전위막 단백질의 특정 수송 활성을 조사하기 위해 방사성 추적 실험에 대한 민감하고 안전하며 저렴한 대안을 개발하고 싶었습니다. 우리는 특히 전기중립으로 작동하는 위 H+,K+-ATPase의 활성을 결정하는 데 관심이 있었는데, 그 이유는 효소가 전류를 생성하지 않기 때문에 그 활성은 전기생리학적 방법으로 해결할 수 없기 때문입니다. Na+,K+-및 H+,K+-ATPase는 Rb+를 K+(및 Li+)만큼 효율적으로 수송하기 때문에 루비듐 또는 리튬에 대한 AAS 기술의 높은 감도는 수송 활동의 민감한 검출을 용이하게 합니다. 원자 흡수 분광 광도계는 화학 실험실에 널리 분포되어 있으며 많은 관심 있는 과학자들이 접근할 수 있어야 하는 일반적인 분석 장치입니다. 또한, 우리는 단일 배치 내에서 단백질 발현 수준과 관련하여 현저하게 낮은 세포 간 변동성을 달성할 수 있는 큰 단일 세포(약 1.0-1.5mm 직경)를 활용하는 <....
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프로토콜
1. Xenopus 난모세포에서의 cDNA 구축 및 단백질 발현
관심 대상인 막 단백질의 cDNA는 pTLN9 또는 pcDNA3.1X10와 같이 Xenopus laevis 난모세포 발현에 적합한 벡터에 클로닝되어야 합니다. 이러한 최적화된 벡터들은 다중 클로닝 부위(MCS) 양옆으로 Xenopus laevis β-글로빈 유전자의 5'- 및 3'-비번역 부위(UTR)를 포함하고 있으며, 5' UTR 앞에는 RNA 중합효소 프로모터 서열(pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7)이 위치하고, MCS의 3' 방향으로는 세포 내 cRNA 안정성을 보장하기 위한 poly-A stretch가 있으며, 그 하류에는 in vitro cRNA 전사를 위한 템플릿으로 사용하기 위해 플라스미드를 선형화할 수 있는 단일 절단 제한 효소 부위 서열이 추가로 포함되어 있습니다.
과발현된 인간 Na+/K+-ATPase (α2-subunit+β1-subunit)의 활성을 난모세포의 내인성 Na+/K+-A....
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결과
Xenopus 난모세포 발현 시스템에서 AAS를 이용해 K+- (또는 Rb+)-대향수송 P-type ATPase에 의한 Rb+ 섭취량을 정량화하면 효소 반응 속도론적 파라미터를 신뢰성 있게 결정할 수 있습니다.
Na+/K+-ATPase의 운송 화학양론 결정
전기발생성 Na+/K+-ATPase의 경우, 순 전하 이동(펌프 전류의 시간 적분)과 Rb+ 이동 간의 상관관계를 분석하기 위한 이전극 전압-클램프(two-electrode voltage-clamp) 실험을 통해 Rb+ 유속을 측정할 수 있습니다. 그림 1A는 1 mM Rb+가 포함된 용액을 Na+,K+-.......
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토론
Na+,K+- 또는 H+,K+-ATPase를 발현하는 개별 Xenopus 난모세포에 흡수되는 Rb+(또는 Li+)의 양을 측정하는 설명된 방법은 양이온 역수송 P형 ATPase에 대한 수송의 동역학적 또는 열역학적 매개변수를 결정하는 다재다능하고 유연하며 정확한 기술임이 입증되었습니다1,4,5,7,8. 방사성 추적자 플럭스 분석에 대한 안전하고 신뢰할 수 있는 대안이며, 상당히 짧은 시간 내에 광범위한 실험 문제를 해결할 수 있습니다. 이에 따라 방사성 추적자24-27을 사용하여 매우 제한된 데이터만 획득되었습니다. AAS 방법은 전기 중성 수송 활성으로 인해 표준 전기생리학으로 분석할 수 없는 H+,K+-ATPase에 특히 유용합니다. 그러나 이 프로토콜에 표시된 예시적인 데이터는 플럭스 측정과 전압 클램핑의 조합이 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 방법 개발의 초기 단계에서 아낌없는 지원을 해준 Ernst Bamberg(막스-플랑크-생물물리학 연구소, 독일), 수많은 유익한 토론을 해준 Kazuhiro Abe(일본 교토 대학), 기술 지원을 해준 Michael Kohl 박사(Analytik-Service, Woltersdorf, 독일)에게 감사를 표합니다. 저자들은 독일 연구 재단 DFG(Cluster of Excellence "Unifying Concepts in Catalysis")의 자금 지원에도 감사를 표하며, 이 기금은 Perkin Elmer AAnalyst 800 장치(SFB 498)에도 자금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4.0 Ethicon Vicryl 봉합사 재료 | Johnson | V633H | |
| Clostridium hystolyticum의 콜라겐분해효소 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| 고순도 PCR 제품 정제 키트 | Roche Applied Science | 11732676001 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| mMessage mMachine Kit SP6/ T7 | Ambion | 1340, 1344 | |
| Ouabain octahydrate | Sigma Aldrich | O3125 | |
| Tricain (에틸 3-aminobenzoate 메탄 설포 네이트 염) | Sigma Aldrich | A5040 | |
| 닭 달걀 흰자위의 트립신 억제제 III-O | Sigma Aldrich | T2011 | |
| SCH28080 | Sigma Aldrich | S4443 | |
| AAnalyst 800 | Perkin Elmer | 0993-5256 | |
| WinLab32TM | Perkin Elmer | ||
| BioPhotometer | Eppendorf | 6131 000.012 | |
| 붕규산 모세 혈관 | 과학 제품 | GB150F-8P | |
| 헤마토크릿 튜브 3.5" | Drummond Scientific | 3 000-203-G/X | |
| 중공 음극 램프 리튬 | Photron | P929LL | |
| 중공 음극 램프 루비듐 | Photron | P945 | |
| 마이크로 피펫 풀러 | Narishige | 모델 PC-10 | |
| 난모 세포 기록 챔버 RC-10 | Warner Instr. | W4 64-0306 | |
| Nanoject II 주입 펌프 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| pCLAMP 소프트웨어 | Molecular Devices | ||
| 폴리프로필렌 샘플 컵 (1.2 ml) | Perkin Elmer | B0510397 | |
| Speedvac - Concentrator 모델 5301 | Eppendorf | 5301 000.210 | |
| THGA 튜브 | Perkin Elmer | B3000641 | |
| 터보 TEC-10CX 증폭기 | NPI 전자 | TEC-10CX |
참고문헌
- Tavraz, N. N., et al. Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine. Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).
- Castillo, J. P., et al.
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재인쇄 및 허가
