패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전기 생리학 녹음 화학적 지질 막에 이온 채널의 재구성이 중요한 단백질의 기능을 식별하고 탐구 할 수있는 강력한 기술이다. 그러나, 평면 이중층과 같은 고전적인 준비는, 재구성 채널과의 멤브레인 환경에서 수행 할 수있는 조작과 실험을 제한 할 수 있습니다. 거대한 리포좀의 더 많은 세포와 같은 구조 지질 환경의 제어를 희생하지 않고도 기존 패치 - 클램프 실험을 허용합니다.
Electroformation는 전극 표면에 증착 얇은 주문한 지질 막에 전압을 교류의 응용 프로그램에 의존 직경 거대한 리포솜에게> 10 ㎛를 생성하는 효율적인 의미입니다. 고전 프로토콜은 유기 용매에서 입금 할 지질 요구 때문에 그러나, 그것은 이온 채널과 같은 덜 강력한 막 단백질과 호환되지 않으며 수정해야합니다. 최근 홍보otocols 우리가 우리의 실험실에서 단백질을 함유 리포솜에 적응 부분적으로 탈수 작은 리포좀에서 거대한 리포좀을 전주 위해 개발되었습니다.
우리는 여기서 배경, 장비, 기술 및 작은 리포좀 분산에서 거대한 리포좀의 electroformation의 함정을 제시한다. 우리는 다음에 더 도전 프로토콜을 시도하기 전에 먼저 마스터해야하는 고전적인 프로토콜로 시작합니다. 우리는 포화 소금 용액과 증기 평형을 사용하여 작은 리포좀의 제어 부분 탈수의 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 electroformation 자체의 과정을 보여줍니다. 우리는 고품질 리포좀을 생산하고 최상의 결과를 보장하기 위해 각 단계에서 준비 육안 검사를 설명하기 위해 사내에서 할 수있는 간단한, 저렴한 장비를 설명합니다.
서론
거대한 리포좀은 (종종 거대한 unilamellar 소포, 또는 GUVs 불리는) 주로 이중층 변형, 측면 상 공존 ( "뗏목"), 막 융합 등 1-4 연구 등의 지질 이중층의 물리학 및 물리 화학을 연구하는 데 사용되었습니다. 쉽게 주변 수성 버퍼보다 다른 할 수있는 수성 내부를 둘러싼 막의 구형 쉘 : 그들은 크게 세포와 같은 구조를 가지고. 그들은 정의에 의해, 직경 ≈ 1-100 μm의, 그래서 그들은 광학 현미경의 다양한 접근 방식을 사용하여 이미지화 할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 소프트하면서, 자신의 속성을 쉽게 처리를 위해 조작 할 수 있도록, 삼투 기울기 또는 기계적으로 적용 장력을 사용하여 팽팽하게 만들 수 있습니다. 특히, 리포좀의 "강성"전기 생리학에 대해 "리포좀 연결"또는 절제 패치를 형성하는 것이 간단하게 제어. 과거에, 이온 채널의 재구성은 크게 평면 지질 B에서 수행되었다ilayers. 이제, 거대한 리포솜에서 패치를 형성하고 기존의 전기 생리학 개발 도구의 상당한 떨림을 (형광 현미경, 마이크로 피펫 포부, 신속한 재관류 및 온도 제어 등)를 사용하는 기능을 재구성 연구 5,6를위한 거대한 리포좀은 점점 더 매력적 수 있습니다.
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프로토콜
1. 유기 용매에서 지질 증착 : 클래식 프로토콜
- . -20 ° C 또는 -80 ° C에서 저장소에서 지질을 제거합니다 RT 따뜻한주의 : 지질은 매우 흡습성이 있으며, 많은 산소에 민감합니다. 건조한 아르곤 또는 질소 가스의 지질을 커버하고 모든 단계에서 공기에 노출을 최소화합니다.
- 필요한 경우, MG / ML 1-10에 클로로포름 또는 헥산에 지질을 중단, 제조 업체의 주장 농도는주의 일반적으로 공칭 것을. 주 : 유기 용제를 사용하는 경우 적절한 장갑 및 기타 개인 보호 장비를 착용하십시오. 대부분의 물질은 여전히이 용매 투과하고 그들이 일시적 보호를 제공하기 때문에 용매, 그들에 유출되는 경우 신속하게 PPE를 제거합니다.
- 에탄올로 두 개의 25 X 37.5 mm ITO 코팅 유리 슬라이드의 양쪽을 청소
- 원하는 몰비를 달성하기 위해 지질을 섞는다. 각 1cm를위한 ITO 면적의 2 입술로 코팅 할 슬라이드아이디, 믹스 ~ 지질의 15-20 μg. . 모두 25 X 37.5 mm 슬라이드가 완전히 코팅 될 것 인 경우에 예를 들어, 우리는 일반적으로 10 ㎎ / ㎖ 지질 혼합물 주 30....
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결과
우리의 예제에서, 우리는 약 55 몰 % POPC (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미 - 포스 포 콜린), 15 몰 % POPS (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미-phosphoserine의 혼합물에서 리포좀을 준비 , 30 몰 % 콜레스테롤, 0.1 몰 % 텍사스 1,2 - dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TXR-DPPE) 레드 라벨.이 구성은 18 신경절 (dorsal root ganglion) 지질의 약 대표로 선택되었다. 우리는 15 몰 %가 청구주의 지질 (여기 POPS)는 (예를 들어, 발데 등. 4) electroformation에서 사용할 수있는 것의 한계 근처에 있습니다.
가수 분해 및 과산화에 의한 지질 분해는 많은 지질 혼합물 많은 중요한 실험 (토론 참조) 특히 중요한 문제입니다. 혼자 명확.......
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토론
거대한 리포좀의 Electroformation은 다양한 지질, 준비하고, 버퍼와 호환 유연한 기술로 개발했다. 지질 증착 공정의주의 깊은 관리가 성공에 가장 중요합니다. 우리는 작은 리포좀 제제 간단한 프로세스에서 지질 조절 증착하기 위해 간단한 도구를 발표했다. 상대 습도는 초기 리포솜의 적절한 탈수 중요하며, 최적의 값은 리포좀 현탁액 용질의 초기 농도가 달라집니다. 낮은 상대 습도는 적절한 수준에 더 집중 샘플을 탈수하는 데 필요합니다.
electroformation에 사용되는 정확한 수화 프로토콜과 전기장 토론 1,4,7,10,11,22의 점 남아있다. 간단한 프로토콜은 높은 소금 농도, 충전 지질, 또는 용융 매우 높은 농도의 존재 리포좀 electroformation을 시도하기 전에 먼저 마스터해야합니다온도 지질 ING. 초기 부종, 성장, 그리고 분리 : 그 기술을 마스터하고 나면, 더 진보 된 프로토콜은 일반적으로 세 부분으로 electrof.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 electroformation 장치 구축을위한 브라이언 Venema의 에릭 마틴 슨 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소의 일반적인 의료 과학 국립 연구소에서 보조금 (SEG에 R01GM100718) 및 보건 국립 연구소의 국립 안과 연구소 (SEG에 R01EY017564)에 의해 재정 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 디지털 멀티미터 | 애질런트 기술, www.agilent.com | U1232A 또는 이와 유사한 | 모든 멀티미터는 가능하지만 테스트 중인 저항에 훨씬 더 많은 전류를 적용하는 구식 아날로그 옴미터는 피하십시오. |
| Fluke | 117 또는 177 | 모든 멀티미터가 가능하지만 테스트 중인 저항에 훨씬 더 많은 전류를 적용하는 구식 아날로그 옴미터는 피하십시오. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A 또는 유사 | 대부분의 함수 발생기는 간단한 프로토콜에서 작동합니다. 이 프로그래밍 가능한 모델은 고급 전기형성 프로토콜에 유용합니다. 발전기가 10V 피크 투 피크를 50 Ω로 구동할 수 있는지 확인하십시오. |
| 로드 ITO 코팅 유리 슬라이드 | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 또는 이와 유사한 | 두 개의 슬라이드를 만들기 위해 반으로 나누십시오, 25mm x 37mm |
| 온도 컨트롤러 | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 또는 이와 유사한 | |
| 습도계 | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| 실리콘 고무 시트 | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | 에 USP 등급 VI 실리콘 사용 |
| Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 또는 유사한 | 제품 Mouser에 의해 배포 www.mouser.com | |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | 다른 형광 표지된 지질을 사용할 수 있지만 TxR-DHPE는 가장 밝고 광안정성이 가장 높은 지질 중 하나입니다. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P 또는 850457C | 지질은 분말(P) 또는 클로로포름(C)으로 주문할 수 있습니다. |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| 콜레스테롤 | Sigma-Aldrich | C8667 |
참고문헌
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000....
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재인쇄 및 허가
