여기 우리는 신경과 hindbrain의 청각 축삭 섬유의 추적 선택을위한 초기 여자의 태아의 청각 신경에 형광 염료를 주입 한 다음 microdissection 기술을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
배아 여자가 주변 및 중앙 신경 세포 투영의 연구 널리 사용되는 모델입니다. 청각 시스템에서 VIIIth 뇌신경에서 청각 axons의 선택적 라벨 중앙의 청각 회로 개발 연구를 강화합니다. 내이 (内耳)의 여러 감각 기관에 VIIIth 신경 하나에 기여하기 때문에이 방법은 도전입니다. 또한, 안정적으로 조류 VIIIth 신경 내 axons의 vestibular 그룹 비해 청각을 구분 마커 식별 할하지 못하고있다. 회로가 형성되기 전에 감각 - evoked 응답이 표시되지로 청각 및 vestibular 경로는 초기 배아에서 기능적으로 구별 할 수는 없습니다. 중앙 돌출 VIIIth 신경 axons는 일부 연구에서 추적 된 있지만, 청각 축삭 라벨은 다른 VIIIth 신경 구성 요소 2,3에서 라벨을 동반되었다. 여기, 우리는 선택적으로 labe로 음향 신경절에서 anterograde 추적하는 방법을 설명개발 VIIIth 신경에서 난 청각 axons. 첫째, 산소 인공 뇌척수에 몰두 8 일 여자는 배의 앞쪽 두부 지역의 부분 절개 한 후, 달팽이 덕트는 해부학 적 랜드 마크 식별 할 수 있습니다. 다음, 고급 당겨 유리 micropipette은 음향 신경절 세포이있는 덕트와 인접 깊은 영역으로 rhodamine dextran 아민의 작은 양을 주입하는 위치입니다. 주사 후 30 분 내에, 청각 axons은 hindbrain에 중앙 추적하고 나중에 histologic 준비에 따라 시각화 할 수 있습니다. 이 방법은 중앙 청각 회로 형성에 주변의 개발 연구를위한 유용한 도구를 제공합니다.
프로토콜
1. 다음 해부 도구와 시약을 준비
- 인공 뇌척수 (aCSF, 130 MM NaCl, 3 MM KCl, 1.2 MM KH 2 PO 4, 20 MM NaHCO 3, 3 MM HEPES, 10 MM 포도당, 2 MM CaCl 2, 1.3 MM MgSO 4) 지속적으로 95% O와 함께 주입 실온에서 2 / 5퍼센트 CO 2. 주입의 경우, 2 / 3 뚜껑에 구멍을 뚫었 구멍 500 ML 넓은 입 Nalgene 병에 입력하십시오. 탱크는 병 뚜껑에있는 구멍을 통해 aCSF을 침투 한 잔 줄기 버블에 튜브가 첨부됩니다. 액체의 1 / 3에 대한 접근하지만 림을 통해 splashing 느낄 수있을만큼 힘없는 거품의 일정한 스트림을 얻기 위해 압력을 조정합니다. 서로와 가스 흐름 난류에서 개별 샘플을 분리 할 수있는 Nalgene 병에 잠기 5 ML 유리 병 (최대 6). ACSF는 모든 조직 배양하기 전에 최소한 20 분 동안 산소를해야합니다.
- 작은 실리콘 분해 요리 (35mm × 10작은 육각형 폴리스티렌으로 배치이 분해 핀 (47 밀리미터 아래)와 함께) Sylgard Elastomere 키트를 사용하여 mm 페트리 코팅은 보트를 무게.
- 두 미세 팁 포셉 한 곡선 팁 포셉, 50 ML의 비커, 그리고 조직 폐기물에 대한 컨테이너입니다.
- 유리 micropipette (1.2 OD / 0.9 ID) 끝에서 열어 약 20-50 μm로 분류하고있는 6.25 %의 용액에 rhodamine dextran 아민 (RDA, MW = 3,000 엔, Invitrogen)로 가득을 뽑아 0.4 % 트리톤 PBS에서 X-100 . micromanipulator에 picospritzer하고 안정화하기 위해 고급 튜브에 연결합니다.
2. 마이크로 해부 E8 4,5에서 뇌 바닥 유두을 나타 내기 위해
- 곡선 포셉으로 배를 무게 내에서 실리콘 코팅 분해 음식에 직접 머리를 배치, 그냥 brainstem 아래 E8 배아를 잘라.
- 관심의 측면에 귀를 약간 볼 수 있도록 분해 핀 사용, 복부 전망을 감상 할 수있는 머리를 배치, 머리가 약간 dorsally 기울여서 10-30도 멀리 CE에서 포인팅nter (그림 2A). 즉시 핀으로 머리를 보호합니다. 양국 추적을 원하는 경우, 센터는 0도에서 머리, 또는 전체 복부 전망은되도록 양쪽에 액세스 할 수 있습니다. 왼쪽에 액세스 할 수 있도록 마찬가지로, 왼쪽 양면 분사를 들어, 센터에서 -10에서 -30도까지 머리를 보호합니다.
- 50 ML의 비커를 사용하여 완전히 조직을 잠수, 그릇에 산소를 aCSF의 30 ML을 전송하기 만하면됩니다.
- 부드럽게 파악하고 미세 팁 집게를 사용하여 아래턱 아래로 껍질을 벗기면 후 관심의 측면에 더 낮은 눈꺼풀을 제거합니다.
- 남은 미각과 식도 등 놓인의 혈관 조직을 제거합니다. 이 부드러운 조직은 벗겨 버릴 표면에 특유의 척추 동맥과 chondrocranium을 개발의 원활한 표면을 공개해야합니다. 이 시점까지, 특성 흰색 otoconial 질량이 표시됩니다.
- 에 떠있는 동안 외부 meatus, 턱 관절의 연골, 그리고 중간 귀 주위 피부를주의 깊게 해부NER 귀 그대로. 부드럽게 이러한 연골 성의 구조를 떼어 포셉을 사용합니다.
- 고급 집게 팁과 부드러운 한눈에 모션을 사용하여 척추 동맥과 풀링 혈액을 제거합니다. 피가보기를 흐릿하게 할 수 있으며 응고은 주입 피펫 열기를 연결 할 수 있습니다.
- 인접 감각 상피 (뇌 바닥 유두) 및 음향 신경과 달팽이 덕트는 chondrocranium 6 바로 아래에 위치해 있으며, 앞쪽 근처의 말초 - 대부분의 팁 (꼭대기)와, ventrally 내이 (内耳)에서 연장 가늘고 긴 손가락과 같은 프로젝션으로 시각화 할 수 있습니다 중간 선 5. 시각화에 도움이 수있는 달팽이 덕트 (그림 2B)의 꼭대기에있는 해부 및 / 또는 otolithic calcifications (흰색)에서 약간의 피가 풀링 (빨간색)가있을 수 있습니다. 꼭대기에서 lagenar 망막 황반은, 감각 패치 vestibular 기능을 7,8 될 생각.
3. CN VIII 청각 섬유의 선택적 라벨링
- 달팽이 덕트 및 뇌 바닥 유두 지역에서 배아 표면 근처의 주입 피펫를 놓습니다.
- 천천히 첫번째 펑크 두개골에 micropipette을 낮 춥니 다. 이 두개의 지역은 주변 지역보다 얇은 적은 힘 침투해야합니다. micropipette 이제 달팽이 덕트 내에 있어야합니다. 선택 사항 : 추적 염료의 작은 주사는 뇌 바닥 유두를 시각화에 도움이 여기를 만들 수 있습니다.
- micropipette를 변경하지 않고, 단지 위반 달팽이 덕트의 깊은 경계 (그림 1)까지 낮추고 계속 진행합니다. 여기 주사를 수행하고 vestibular lagena가있는 대부분의 근위 팁을 제외 뇌 바닥 유두 (그림 2C, 2D)의 길이를 따라 여러 지역에서 반복합니다. 10-30 PSI 사이에 자리 잡고 picospritzer으로 여러 주사가 만들어집니다. 주입 염료 유체의 볼륨은 다양하고, 원하는 라벨의 범위에 따라 달라집니다. 각각의 주입은 형광 염료 라가 될약 200 beled 명소 - 400 μm의 직경 (그림 2D).
- 주입이 완료되면, brainstem 위의 샘플을 가로로 쪼개다 지속적으로 95% O 5분의 2 % CO 2와 perfused되는 aCSF의 컨테이너 내에서 작은 병으로 꼬리 부분을 배치 전송 피펫을 사용하여 집게를 사용합니다.
- 각 배아를 들어, 원하는 중앙 추적의 거리에 따라, 염색 전송을위한 20-30 분 수 있습니다.
- 조직을 제거하고 조직 학적 sectioning를 준비합니다. 여기에 표시된 예에서, 조직은 4 % paraformaldehyde (1X PBS에서) 밤 밤, 30 %의 자당 (1X PBS에서)에 몰두하고 있습니다.
4. Counterstaining 및 분석
- Counterstaining는 방향뿐만 아니라 관심의 특정 지역을 파악로 해부학 적 위치에 관찰자 도움 유용합니다. 이 준비 효과적인 counterstain 강력히 리터 neurofilament의 immunolabeling (그림 1, 3B, 3E)입니다abels는 axons과 CNS의 axonal 책자의 경계 할 수 있습니다.
- 예측이 rostrocaudal 축을 따라 수백 미크론 이상을 연장 할 수 있으므로 분석이 표시된 지역에 걸쳐 수행해야합니다. 기본적인 분석의 몇 가지 예는 다음과 같습니다 타겟팅 오류 속도, 타이밍 및 / 또는 프로젝션 패턴의 발산의 변화. RDA - 표시 axons은 고해상도 (인물 3A, 3D)와 주변 장치 및 중앙 신경 시스템의 시각화 수 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
VIIIth 신경과 신경 자체의 해부학 적 구조의 구성 요소는 (그림 1, 3) 복잡하고 복잡합니다. 선택적으로 음향 신경절 세포에서 발생하는 섬유를 추적함으로써, VIIIth 신경뿐만 아니라 brainstem 내의 기본 청각 afferents의 세그먼트는 완전히 추적 할 수 있으며, 자신의 vestibular 대응 (그림 2, 3)에서 구별. 마찬가지로,이 기법은 음향 신경절 세포의 주변 계획 (그림 3G)을 연구하는 데 사용, 또는 개인 vestibular 기관에서 발생하는 예측을 공부하도록 수정 될 수 있습니다. axons가 완전히 자신의 전체 길이를 따라 추적하기 때문에 정확한 정량 분석은 또한 청각 섬유 라벨의 이전 방법과는 달리, 초기 innervation의 정확한 타이밍과 패턴 등을 포함하여 개발 기간 동안 vestibular 예측, 타겟팅, 오류 요금 등의 구별 청각을 수행 할 수 있습니다 이 방법은 per...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
VIIIth 신경의 초기 개발 연구로 인해 여러 별개의 신경절에서 발생하는 배아 axons을 식별하는 어려움의 일부에 제한되어 있습니다. 몇몇 연구는 초기 개발 기간 동안 청각 및 vestibular 감각 세포와 신경 세포의 운명을지도 분자 신호, 5,11,12을 탐험했지만 중앙 innervation을 규제 프로세스는 결정하지 못하고있다. 이하는 주요 핵에 투영 중심 프로세스에 대해 알려진 반면, 음향 신경절 세포 계획의 보고서는 일반적으로 감각 상피 13-15로 주변 프로세스를 설명합니다. embryogenesis 동안 중앙 돌출 VIII의 제트 연료의 파이프의 연구는 포유류의 조직 슬라이스 17 배아 여자의 hindbrain 16 칼슘 이미징의 광학 녹음으로 자주 electrophysiological이지만 이전 신경 회로의 완성을 수행 할 수 없습니다. 라벨 면역 마커의 사용여자 VIIIth 신경의 청각 axons은 현재 적합하지 않을 수 있습니...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심의 충돌이 선포되지 않습니다.
감사의 글
저자는 초기 embryogenesis 동안 여자는 귀에 해부학 적 구조에 대한 전문 지식을위한 이미징 기술과 박사 도리스 우와 제안과 도움을 박사 캔디스 Hsieh 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 및 DOE GAANN P200A120165에 의해 지원되었다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 폴리스티렌은 요리를 체중 | 피셔 과학 | 02-202-101 | |
| 페트리 접시 35 X 10mm | 피셔 과학 | 50820644 | 실리콘 해부 요리를 만들기 위해 사용 |
| Sylgard 실리콘 엘라스토머 키트 | 세계 정밀 계측기 | SYLG184 | 코트 페트리는 분해 요리를하기 위해 |
| 해부 핀 | 여러 | 해부 동안 장소에 배아를 가지고 | |
| NaCL | 여러 | aCSF 제조법의 일부 | |
| KCl | 여러 | aCSF 제조법의 일부 | |
| KH 2 PO 4 | 여러 | aCSF 제조법의 일부 | |
| NaHCO 3 | 여러 | aCSF 제조법의 일부 | |
| 포도당 | 여러 | aCSF 제조법의 일부 | |
| CaCl 2 | 여러 | aCSF 제조법의 일부 | |
| MgSO 4 | 여러 | aCSF 제조법의 일부 | |
| aCSF에 대한 컨테이너입니다. 뚜껑과 반투명 넓은 입 Nalgene 병, 500 ML (16 오즈를) 제안합니다. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | 유리 bubling 줄기에 뚜껑의 상단에 드릴 홀 개구는 액체 침투하는 |
| 빈 5 ML의 유리관 또는 유사한 투명 유리 병 | 미국의 제약 파트너, Inc의 | 6332300105 | 서로와 버블 링 스트림에서 샘플을 별도의 유지 aCSF의 배양시 사용 |
| carbogen의 탱크 (95% O 5분의 2 % CO 2) 버블에 튜브로 연결 | 여러 | aCSF에 주입을위한 유리의 줄기 버블에 튜브하여 첨부 | |
| 유리 줄기 버블 | 여러 | aCSF에 carbogen을 불러 일으킬 수있는 | |
| 곡선 팁 포셉 | 세계 정밀 계측기 | 501008 | 난자에서 배아의 머리를 제거하려면 |
| 두 미세 팁 포셉 | 세계 정밀 계측기 | 501985 | 마이크로 해부에 대한 |
| 50 ML의 비커 | 여러 | ||
| Rhodamine Dextran 아민 (RDA) | Invitrogen | 여러 | 형광 축삭 트레이서 |
| 트리톤 X-100 | ICN의 Biomedicals | ||
| 인산염은 (1X PBS), 식염 버퍼 | 여러 | 표준 실험실 시약 | |
| 얇은 벽 유리 모세 혈관, 1.2 OD, 0.9 ID 4 "(100 ㎜) 길이 | 세계 정밀 계측기 | TW120F-4 | RDA와 함께로드합니다. 각 모세는 두 유리 micropipettes하게 |
| 니들 / 피펫 풀러 | 데이비드 Kopf 악기 | 모델 720 | 사용 설정 : 열 16.4, 솔레노이드 2.2 |
| Picospritzer | 파커 계측 | 여러 | 유리 micropipette으로 미세 튜브에 첨부 |
| Micromanipulator | Narishige | 여러 | |
| 형광과 해부 현미경 | 여러 | ||
| 4 % Paraformaldehyde | 여러 | 표준 실험실 시약 | |
| 안티 Neurofilament 항체, 선택 사항 | Millipore | AB1991 | 제조업체에서 권장하는 조직 학적 프로토콜에 따라 |
| 그라 이오 스탯과 sectioning에 대한 관련 자료 | Leica | 여러 | |
| 이미지에 대한 Epifluorescent 현미경 | 다양한 Zeiss, |
참고문헌
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144(2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
