조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

요약

여기 우리는 신경과 hindbrain의 청각 축삭 섬유의 추적 선택을위한 초기 여자의 태아의 청각 신경에 형광 염료를 주입 한 다음 microdissection 기술을 설명합니다.

초록

배아 여자가 주변 및 중앙 신경 세포 투영의 연구 널리 사용되는 모델입니다. 청각 시스템에서 VIIIth 뇌신경에서 청각 axons의 선택적 라벨 중앙의 청각 회로 개발 연구를 강화합니다. 내이 (内耳)의 여러 감각 기관에 VIIIth 신경 ^하나에 기여하기 때문에이 방법은 도전입니다. 또한, 안정적으로 조류 VIIIth 신경 내 axons의 vestibular 그룹 비해 청각을 구분 마커 식별 할하지 못하고있다. 회로가 형성되기 전에 감각 - evoked 응답이 표시되지로 청각 및 vestibular 경로는 초기 배아에서 기능적으로 구별 할 수는 없습니다. 중앙 돌출 VIIIth 신경 axons는 일부 연구에서 추적 된 있지만, 청각 축삭 라벨은 다른 VIIIth 신경 구성 요소 ^2,3에서 라벨을 동반되었다. 여기, 우리는 선택적으로 labe로 음향 신경절에서 anterograde 추적하는 방법을 설명개발 VIIIth 신경에서 난 청각 axons. 첫째, 산소 인공 뇌척수에 몰두 8 일 여자는 배의 앞쪽 두부 지역의 부분 절개 한 후, 달팽이 덕트는 해부학 적 랜드 마크 식별 할 수 있습니다. 다음, 고급 당겨 유리 micropipette은 음향 신경절 세포이있는 덕트와 인접 깊은 영역으로 rhodamine dextran 아민의 작은 양을 주입하는 위치입니다. 주사 후 30 분 내에, 청각 axons은 hindbrain에 중앙 추적하고 나중에 histologic 준비에 따라 시각화 할 수 있습니다. 이 방법은 중앙 청각 회로 형성에 주변의 개발 연구를위한 유용한 도구를 제공합니다.

프로토콜

1. 다음 해부 도구와 시약을 준비

• 인공 뇌척수 (aCSF, 130 MM NaCl, 3 MM KCl, 1.2 MM KH ₂ PO _4, 20 MM NaHCO _{3, 3} MM HEPES, 10 MM 포도당, 2 MM CaCl _2, 1.3 MM MgSO ₄₎ 지속적으로 95% O와 함께 주입 실온에서 ₂ / 5퍼센트 CO _2. 주입의 경우, 2 / 3 뚜껑에 구멍을 뚫었 구멍 500 ML 넓은 입 Nalgene 병에 입력하십시오. 탱크는 병 뚜껑에있는 구멍을 통해 aCSF을 침투 한 잔 줄기 버블에 튜브가 첨부됩니다. 액체의 1 / 3에 대한 접근하지만 림을 통해 splashing 느낄 수있을만큼 힘없는 거품의 일정한 스트림을 얻기 위해 압력을 조정합니다. 서로와 가스 흐름 난류에서 개별 샘플을 분리 할 수​​있는 Nalgene 병에 잠기 5 ML 유리 병 (최대 6). ACSF는 모든 조직 배양하기 전에 최소한 20 분 동안 산소를해야합니다.
• 작은 실리콘 분해 요리 (35mm × 10작은 육각형 폴리스티렌으로 배치이 분해 핀 (47 밀리미터 아래)와 함께) Sylgard Elastomere 키트를 사용하여 mm 페트리 코팅....

결과

VIIIth 신경과 신경 자체의 해부학 적 구조의 구성 요소는 (그림 1, 3) 복잡하고 복잡합니다. 선택적으로 음향 신경절 세포에서 발생하는 섬유를 추적함으로써, VIIIth 신경뿐만 아니라 brainstem 내의 기본 청각 afferents의 세그먼트는 완전히 추적 할 수 있으며, 자신의 vestibular 대응 (그림 2, 3)에서 구별. 마찬가지로,이 기법은 음향 신경절 세포의 주변 계획 (그림 3G)을 연구하는 데 사용, 또는 개인 vestibular 기관에서 발생하는 예측을 공부하도록 수정 될 수 있습니다. axons가 완전히 자신의 전체 길이를 따라 추적하기 때문에 정확한 정량 분석은 또한 청각 섬유 라벨의 이전 방법과는 달리, 초기 innervation의 정확한 타이밍과 패턴 등을 포함하여 개발 기간 동안 vestibular 예측, 타겟팅, 오류 요금 등의 구별 청각을 수행 할 수 있습니다 이 방법은 per.......

토론

VIIIth 신경의 초기 개발 연구로 인해 여러 별개의 신경절에서 발생하는 배아 axons을 식별하는 어려움의 일부에 제한되어 있습니다. 몇몇 연구는 초기 개발 기간 동안 청각 및 vestibular 감각 세포와 신경 세포의 운명을지도 분자 신호, ^5,11,12을 탐험했지만 중앙 innervation을 규제 프로세스는 결정하지 못하고있다. 이하는 주요 핵에 투영 중심 프로세스에 대해 알려진 반면, 음향 신경절 세포 계획의 보고서는 일반적으로 감각 상피 ^13-15로 주변 프로세스를 설명합니다. embryogenesis 동안 중앙 돌출 VIII의 제트 연료의 파이프의 연구는 포유류의 조직 슬라이스 ¹⁷ 배아 여자의 hindbrain ¹⁶ 칼슘 이미징의 광학 녹음으로 자주 electrophysiological이지만 이전 신경 회로의 완성을 수행 할 수 없습니다. 라벨 면역 마커의 사용여자 VIIIth 신경의 청각 axons은 현재 적합하지 않을 수 있습니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
폴리스티렌은 요리를 체중	피셔 과학	02-202-101
페트리 접시 35 X 10mm	피셔 과학	50820644	실리콘 해부 요리를 만들기 위해 사용
Sylgard 실리콘 엘라스토머 키트	세계 정밀 계측기	SYLG184	코트 페트리는 분해 요리를하기 위해
해부 핀	여러		해부 동안 장소에 배아를 가지고
NaCL	여러		aCSF 제조법의 일부
KCl	여러		aCSF 제조법의 일부
KH 2 PO 4	여러		aCSF 제조법의 일부
NaHCO 3	여러		aCSF 제조법의 일부
포도당	여러		aCSF 제조법의 일부
CaCl 2	여러		aCSF 제조법의 일부
MgSO 4	여러		aCSF 제조법의 일부
aCSF에 대한 컨테이​​너입니다. 뚜껑과 반투명 넓은 입 Nalgene 병, 500 ML (16 오즈를) 제안합니다.	CPLabSafety	QP-PLC-03717	유리 bubling 줄기에 뚜껑의 상단에 드릴 홀 개구는 액체 침투하는
빈 5 ML의 유리관 또는 유사한 투명 유리 병	미국의 제약 파트너, Inc의	6332300105	서로와 버블 링 스트림에서 샘플을 별도의 유지 aCSF의 배양시 사용
carbogen의 탱크 (95% O 5분의 2 % CO 2) 버블에 튜브로 연결	여러		aCSF에 주입을위한 유리의 줄기 버블에 튜브하여 첨부
유리 줄기 버블	여러		aCSF에 carbogen을 불러 일으킬 수있는
곡선 팁 포셉	세계 정밀 계측기	501008	난자에서 배아의 머리를 제거하려면
두 미세 팁 포셉	세계 정밀 계측기	501985	마이크로 해부에 대한
50 ML의 비커	여러
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트리톤 X-100	ICN의 Biomedicals
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니들 / 피펫 풀러	데이비드 Kopf 악기	모델 720	사용 설정 : 열 16.4, 솔레노이드 2.2
Picospritzer	파커 계측	여러	유리 micropipette으로 미세 튜브에 첨부
Micromanipulator	Narishige	여러
형광과 해부 현미경	여러
4 % Paraformaldehyde	여러		표준 실험실 시약
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