방법 논문

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

DOI:

10.3791/50310

⸱

2013년 4월 4일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

이 논문에서

요약

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라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

초록

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세포는 세포 외 기질 및 성장 요인과 같은 수용성 신호의 glycoproteins와 같은 접착제 신호의 높은 농도를 향해 감지하고 마이그레이션 할 수 있습니다. 여기, 우리는 라이브 세포 이미징와 호환되는 마이크로 유체 챔버에 접착제 및 가용성 신호의 반대 그라디언트를 만드는 방법을 설명합니다. 폴리-L-라이신 및 폴리에틸렌 글리콜 (PLL-PEG)의 공중 합체는 유리 coverslips을 패시베이션 및 분자 및 세포의 비 특정 흡착을 방지하기 위해 사용된다. 다음 microcontact 인쇄 또는 딥 펜 리소그래피는 접착제 단서로 biotinylated 펩타이드 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 (RGD)에 포인트를 고정 역할을 passivated 표면에 streptavidin의 트랙을 만드는 데 사용됩니다. 마이크로 유체 장치는 수정 표면에 배치하고 streptavidin 트랙에 접착제 신호 (100 % 0 % RGD에 RGD)의 기울기를 만드는 데 사용됩니다. 마지막으로, 같은 마이크로 유체 장치는 chemoattractant suc의 기울기를 만드는 데 사용됩니다접착제 신호의 기울기의 반대 방향으로 용해 신호로 태아 소 혈청 (FBS)과 같은 H.

서론

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감독 세포 이주는 많은 세포의 기본 특성이며, 배아 개발, 감염에 대한 방어와 상처 치유 등 많은 정상적인 생리 과정의 핵심 부분입니다. 또한, 세포 마이그레이션은 또한 혈관 질환, 종양 세포의 전이 및 만성 염증의 1,2 등 여러 질병에 눈에 잘 띄는 역할을합니다. 클래식 세포 마이그레이션 상태 동안 - 편광, 돌출부 확장, 부착, 힘 생성 및 후면 철회 형성은 - 일반적으로 3,4를 사용할 수 있습니다, 신호 통합 조정하는이 spatiotemporal 메커니즘의 해설이 더 도전했습니다.

세포 외 기질 (ECM)은 세포 접착을위한 기판으로 제공하며, 고유의 화학 5 물리적 여섯 다양성을 통해, 셀 탐색 7,8에 대한 방향 신호를 제공합니다. 이러한 접착제 단서 9, 수용성 요소 10-12 외에도 </ 저녁을 먹다> 같은 chemokines 및 성장 요인으로 할 수 chemoattractant 수용체 및 하류 motogenic 신호를 통해 직접 세포 이주를 유도. 현재, 그것은 참여와 유착 수용체 (즉, integrins) 또는 수용체 티로신 키나제의 (RTK)와 같은 chemoattractant 수용체를 통해 신호가 지배적인지 알 수 없습니다. 또한이 수용체 시스템의 계층 셀 타입 특정 있는지 여부 알려져 있습니다.

라이브 세포 현미경은 대량 assays에 액세스 할 수 있으며, 고정 13,14 및 가용성 단서 15 16의 그라디언트를 생성하기 위해 마이크로 유체 장치와 결합 될 수있는 정보의 풍부한을 제공합니다. 여기에 설명 된 방법은 쉽게 세포 생물학 연구실 (그림 1)으로 구현 될 수있는 세포 마이그레이션에 대한 이미지 분석을 만들 수있는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 챔버와 함께 표면 변형에 대한 간단하고 안정적인 일련의 단계를 사용합니다. 조립마이크로 유체 장치는 유리 17 비교하고 diffusible 분자의 기울기는 최소 16 시간을위한 안정적인 광학 특성이 있습니다. 이 시스템은 epifluorescence 및 고급 현미경 기술을 사용할 수 있습니다. 다른 chemotaxis 설정에서 18과는 달리,이 시스템은 천천히 마이그레이션, 자기편 세포를 녹음에 적합합니다. 중요한 시스템은 모듈 방식이며, 쉽게 대체 접착제 또는 용해 마이그레이션 단서 및 다양한 세포 유형의 시험의 소개가 있습니다.

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프로토콜

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1. PLL-PEG-비오틴과 유리 Coverslips의 패시베이션

이 단계는 그 세포가 microcontract 인쇄 (2 단계-3A) 또는 딥 펜 리소그래피 (단계 3B)로 만든 유리 coverslip의 특정 지역에 준수하고 마이그레이션 있도록 표면을 패시베이션하기 위해 설계되었습니다. 패시베이션를 들어, 폴리-L-라이신 (PLL) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공동 폴리머는 PEG 분자의 20 %가 비오틴 (PLL-PEG-비오틴)에 이식되는 사용됩니다.

  1. 유리 coverslips (18mm X 18mm), 100 % 에탄올의 랙에 잠수함을 청소하고 30 분에 sonicating 목욕탕에서 랙을 배치합니다. 공기 또는 질소의 흐름에 따라 유리 coverslips를 말린다.
  2. 다음 1 M NaOH의 30 분의 유리 coverslips를 sonicate. 이후 조심스럽게 1.5 L 밀리 Q H 2 O.로 가득 찬 비커에 랙을 찍어하여 유리 표면을 세정 린스 과정을 신선한 밀리 Q H 2 O 할 때마다 사용을 세 번 반복합니다. 에 유리 coverslips을 건조60 오븐 ° C.
  3. 깨끗한 유리의 장소 반은 부분적으로 H 2 O.로 가득 찬 24 잘 플레이트로 구성되어 습기 챔버에 개별적으로 coverslips 각 유리 coverslip에 PBS에서 PLL-PEG-비오틴 (1 MG / ML) 15 μl를 버려라. 나머지 깨끗한 유리 coverslips의 다른 반쪽을 가지고주의 깊게 샌드위치 PEG 솔루션을. 습기 챔버에서 1 시간 동안 coverslips 둡니다. PEG-코팅 표면을 스크랩 않고 부드럽게 거리에 서로 끼어 coverslips을 밀고 밀리 Q H 2 O.과 함께 씻어 물은 PEG-처리 측면에 감정 밀어해야합니다. 필요한 경우, 치료를 표면과 종이 타월에 공기 건조 유리 coverslips이 위쪽으로 향하고 있습니다. 자세한 사용까지 진공 건조기에서 유리 coverslips를 저장합니다.

2. Microcontact 인쇄를위한 우표의 제작

우리는 passivated 유리 coverslips에 패턴 streptavidin 트랙 두 프로세스를 설명합니다. 첫 번째, 마이크rocontact 인쇄는 일반적으로 PDMS 스탬프가 캐스팅되어있는 실리콘 마스터의 제조가 필요합니다. 우리의 경우, PDMS 스탬프의 패턴은 25 μm의 기능 높이 290 μm 센터 - 투 - 센터를 간격을두고 아르 100 μm 전체 선입니다. 다음, 우리는 적절한 실리콘 마스터 (단계 2.1-2.3)와 PDMS 스탬프 (단계 2.4) 제조하는 방법을 간단히 설명합니다. 그러나, 유리 coverslips에 단백질 패턴을 인쇄에 적합한 문헌 19-23에 설명 microcontact 인쇄에 대한 여러 프로토콜이 있습니다. 석사도 맞춤 제작과 상업 소스에서 구입하실 수 있습니다.

  1. MilliQ H 2 O.으로 철저하게 10 시간 20 분의 웨이퍼를 씻어. : 첫째, 피라냐 솔루션 (황산 산의 V와 30 % 과산화수소 3시 1분 V)에 잠복기하여 실리콘 웨이퍼 (4 "직경)을 청소 150 오븐에 웨이퍼를 건조 ° CO / N.
  2. 백퍼센트 이소 프로필 알코올에 이어 100 % 아세톤으로 깨끗하고 마른 실리콘 웨이퍼를 씻어. 다음40 초 동안 3,100 rpm으로 웨이퍼 위에 GM1070 SU-8 포토 레지스트 (Gersteltec SARL)의 스핀 코트 2 ML은 25 μm 두께의 레이어를 만들 수 있습니다. 샘플 후 95에서 추가로 5 분 뒤에 5 분 ° C.에 65 ° C에서 핫 플레이트에 구운합니다
  3. 원하는 패턴 (Quintel Q6000 마스크 aligner를 사용하는 예를 들어)와 photomask에서 60 초에 UV 빛 SU-8 포토 레지스트를 노출하고 제빵 과정은 2.2에서 설명 반복합니다. 그런 다음 샘플 100 % 이소 프로필 알코올에 헹구어 및 질소 흐름 하에서 건조 4 분에 대한 SU-8 개발자 (Gersteltec SARL)에 웨이퍼를 immersing에 의해 개발되었습니다. UV 빛에 노출되지 SU-8 포토 레지스트의 영역은 따라서 PDMS 스탬프의 역 패턴을 생성, 삭제됩니다.
  4. 다음 단계는 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 캐스팅하는 것입니다. 첫째, 철저하게 엘라스토머 성 예비 중합체의 10 부품 (Sylgard 184)와 경화 에이전트 한 부분을 (w / w) 섞는다. 진공 라인에 부착 된 건조기에서 가스를 제거하다에게, 혼합물을 공기 방울을 제거하려면1 시간에. 다음, 높이 약 1cm에 페트리 접시 안에 실리콘 마스터에 PDMS 엘라스토머을 부어 1 시간 70에서 오븐 ° C에서 마스터와 PDMS 혼합물을 치료. 마지막으로, PDMS 스탬프는 실리콘 마스터에서 제거하고 크기로 절단됩니다.

3. Passivated 유리 Coverslips로 패턴의 Streptavidin 또는 접착제 큐

유리 coverslips을 부동화 한 후, 단백질 패턴은 microcontact 인쇄 (단계 3A) 또는 딥 - 펜 리소그래피 (단계 3B)로 인쇄됩니다. 우리의 경우, streptavidin는 RGD의 기울기 (4 단계)을위한 기반을 형성 선,로 인쇄됩니다. 동일한 절차는 접착제 패턴을 만들 매트릭스 단백질을 인쇄에 사용할 수 있습니다.

표면 위에 분자의 패터닝을위한 microcontact 인쇄에 대한 대안 방법은 딥 펜 리소그래피입니다. 딥 펜 리소그래피에서 캔틸레버는 표면에 솔루션의 작은 볼륨을 전송하는 데 사용됩니다. cantilevers의 크기, V솔루션의 점성이 표면에 캔틸레버 시간에 문의 인쇄 챔버의 표면과 습도의 소수성는 인쇄 기능의 크기를 확인합니다. 이 방법의 장점은 주인과 우표를 조작 할 필요가 없습니다에 따라 다른 패턴이 각 실험 인쇄 할 수 있다는 것입니다. 단점은 주어진 패턴을 인쇄 딥 펜 리소그래피는 많은 실험실에서 사용하지 못할 수 있습니다 전문 악기를 요구하는 데 시간이 오래 걸립니다 있다는 것입니다. 우리가 사용하는 딥 펜 리소그래피 장비는 Bioforce Nanoscience에서 NanoeNabler했다. 여기, 우리가 SPT10 cantilevers를 사용하는, 직경 <10 μm이었다 작은 점을 출력한다.

3A. Microcontact 인쇄 (μCP) 기술

  1. 세척 및 PDMS 스탬프가 더 친수성 ​​수 있도록, 1.5 시간에 대한 UV와 오존 (Bioforce Nanoscience에서 예를 들어, UV 오존 Procleaner)의 PDMS 스탬프의 패턴 측면을 취급합니다. 또한, 플라즈마를 사용하여같은 목적을 위해 짧은 시간에 청소기. 이 과정은 인쇄 과정을 개선 산화 PDMS 표면 24, 만듭니다.
  2. 오존 또는 플라즈마 치료, 장소와는 PDMS 스탬프에 10 μl streptavidin을 (PBS 1 MG / ML) 확산과 습윤 챔버 (예 : 부분적으로 채워진 6 잘 판으로, 단계 1.3 참조) 1 시간에 출발 후 즉시 . 트랙 형광 현미경으로 볼 수 있어야 경우, 해당 streptavidin-AlexaFluor350 같은 형광에 복합이다 streptavidin을 사용합니다.
  3. 조직 종이와 공기를 약 1 분 동안 우표를 건조와 도장에서 초과 streptavidin을 제거합니다. 살짝 PLL-PEG-비오틴 - 코팅 유리 coverslip에 도장을 누릅니다.
  4. 형광 streptavidin이 단계 3.a2에 사용 된 경우 epifluorescence 현미경을 사용하여 패턴을 검사합니다. 건조기에 인쇄 된 표면을 저장합니다.

3B. 수영 펜 리소그래피

  1. 먼저, 1 MG / ML streptavidin 또는 stre의 1 부분을 혼합글리세롤의 10 부분 (V / V)와 ptavidin - AlexaFluor350하고 캔틸레버에 혼합물의 5 μl를로드합니다. 딥 펜 리소그래피 장비의 작동 설명서에 설명 된대로 다음 인쇄 작업을 시작합니다. 약 5 μm의 스폿 사이즈를 줄이기 위해 인쇄 속도를 조정하고, 표면에 캔틸레버의 표면 또는 수직 거리에 캔틸레버의 시간을 문의하십시오. 그림 2C에 표시된 예에서, 점 행과 10-15 μm로 설정 열 분리와 라인에 인쇄되었습니다. 이 거리가 서로 병합에서 점을 방지하기 위해 충분하지만 대부분의 현미경 설정보기의 단일 필드에 여러 점의 볼 수 있습니다.
  2. 건조기에 인쇄 된 표면을 저장합니다.

4. Streptavidin-패턴 표면 위에 접착제 그라디언트를 만들기

우리는 streptavidin (그림 3) 또는 공동으로 코팅되어 유리 coverslips에 비오틴-RGD의 접착제 그라디언트를 만들passivated 유리 coverslips에 ntain streptavidin 패턴 (그림 5). 표면 기울기를 만들려면, 우리는 수동적 확산에 의해 안정적인 솔루션 기울기를 만들어 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 장치 (Ibidi에서 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D이라고도 함) 사용됩니다. streptavidin 구속력이 사이트에 대해 경쟁하기 위해, 우리는 (그림 1 참조) RGD에 복합 아니었다 비오틴-RGD과 비오틴의 두 반대 그라디언트를 고용.

  1. 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D 장치의 끈적한면에 streptavidin - 코팅 또는 패턴 유리 coverslips을 준수합니다. 몇 시간에 대한 누설이없는 것을 확인하려면, 장치의 가장자리는 따뜻하게 바셀린의 얇은 층으로와 파라핀 왁스의 1 부분 (w / w)에 바세린 1 부분의 혼합물의 두 번째 층으로 밀봉되어 있습니다.
  2. 채널 6 μl PBS로 장치의 채널을 입력합니다. 그런 다음 PBS 70 & m에서 0.03 μg / μl 비오틴-4-fluorescein의 70 μl로 두 저수지를 작성U, 0.03 μg의 L / μl 비오틴-RGD 각각 PBS 인치 1 시간에 어둠 속에서 RT의 샘플을 품다.
  3. 비오틴 솔루션을 제거하고 여전히 PBS로 두 번 마이크로 유체 장치에 부착 동안주의 깊게 표면을 씻어. 접착제 그라디언트의 방향을 표시하고 필요한 경우에 대해 4 ° C에서 PBS로 가득 장치를 저장하지만 장치가 밖으로 건조하지 않도록. 필요한 경우, 형광 현미경으로 접착제 기울기를 분석 할 수 있습니다.

5. 라이브 셀 이미징에 대한 Fluorophores과 세포의 Labelling

세포는 형광 현미경으로 세포 추적을 지원 형광 염료로 표시됩니다. 일반 프로브는 형광 세포 기관 마커, 세포 핵을 레이블 등 Syto 64 레드입니다. 이렇게하려면 셀을 먼저 한 다음 45 분을위한 문화 미디어 1 μM Syto 64 레드와 incubated, PBS로 세 번 씻어 마지막으로 PBS를 추가로 세 번 씻어 수 있습니다. 세포가 아니어야합니다오랜 기간 동안 PBS에 보관.

셀 추적의 대체 염료는 세포질에 얼룩 CellTracker 시리즈이며, 세포 마이그레이션 및 부서 동안 유지됩니다. 형광 융합 단백질과 세포의 Transfection는 마이그레이션하는 동안 관심의 단백질의 subcellular 배포판을 기록 할 특히 유용합니다. 그러나, 유기 염료보다 일반적으로 사진 표백제를 빠르게 형광 단백질은 장기 관찰 있도록 할 수없는 경우가 있습니다.

6. Microfluidics 장치로 가용성식이 그라데이션으로 셀의로드

  1. 동일한 전화 번호의 두 튜브로 휘황 표시 셀 및 분할을 계산합니다. 이러한 10% 태아 소 혈청 (FBS)과 낮은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)로 chemoattractant를 포함하는 미디어와 셀 중 하나 관을 씻고 resuspend. 세탁 및 chemoattractant, 0퍼센트 FBS와 즉 DMEM없이 미디어 세포의 다른 튜브를 resuspend. 최종 농도각 튜브에 세포의 5 × 10 5 세포 / ML해야합니다.
  2. 마이크로 유체 장치 (단계 4.3에서)에서 모든 솔루션을 제거하고 (7 단계 참조) 현미경 스테이지에 배치합니다. 한 저수지와 다른에 HELA 세포의 70 μl (10 % FBS DMEM 5 × 10 5 세포 / ML)로 세포의 70 μl를 (0 % FBS DMEM 5 × 10 5 세포 / ML)로드합니다. 대충 증발을 방지하기 위해 저수지 위에 테이프를 배치합니다. 표면에 세포가 이전 영상에 대한 사전 incubated 경우,이 세포는 그라디언트없이 성장 미디어 장치에로드하는 것이 좋습니다. 장치는 다음 현미경 스테이지에 배치하고 미디어는 다른에서 10 % FBS와 하나 저수지와 DMEM에 FBS가없는 그라디언트 미디어 즉 DMEM로 대체됩니다.

7. 세포 이미징 및 데이터 분석 라이브

  1. 현미경 (니콘 티-E)에 전환하고 실험을 시작하기 전에 적어도 1 시간을 무대를 따뜻하게.
  2. 확인이 micr의 채널ofluidic 장치가 시야에 있으며 셀이 초점에 있습니다. 이러한 노출 시간과 형광 필터, 셀 및 트랙을 캡처 시야 및 형광의 이미지 시퀀스뿐만 아니라 시간 포인트 및 녹화 길이 (예 : 16 시간마다 15 분) 등의 이미지 수집 매개 변수를 선택합니다.
  3. 이러한 ImageJ 수동 추적 또는 Ibidi Chemotaxis 및 마이그레이션 도구 적절한 소프트웨어와 데이터를 분석합니다.

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결과

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셀 철새 신호를 25 통합 방법을 이해하기 위해, 우리는 경쟁 접착제 및 가용성 그라디언트 (그림 1) 환경에서 마이그레이션하는 형광 현미경으로 이미지 셀에 방법을 개발했습니다. 형광 streptavidin과 biotinylated RGD를 포함 접착제 트랙이 microcontact 인쇄 트랙과 딥 펜 리소그래피 (그림 2)로 만들어졌습니다. 성공적인 microcontact 인쇄는 접착제 트랙과 안티 오염 지역 명확하게 (그림 2B) 구별 할 수있는 트랙에서 형광 강도의 라인 프로파일로 표시됩니다. 딥 펜 리소그래피로 인쇄 점 반올림, 성공적인 인쇄 프로세스를 나타냅니다 모양 찢어 지지도 않아요 나타납니다. 표면 화학 및 습도는 인쇄 프로세스의 결과에 영향을 미칩니다. 일반적으로, 더 소수성 표면은, 인쇄 결과수록 좋습니다.

접착제 신호의 기울기인쇄 트랙에 비오틴-4...

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토론

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이 프로토콜에서는, 우리는 세포 이주에 대한 화학적으로 수정 표면과 chemoattractant 그라디언트의 효과를 연구하기 (Ibidi에서 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D) 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 장치를 사용했습니다. 그라디언트는 채널의 길이를 따라 확산에 의해 설립되기 때문에 이러한 마이크로 유체 설정은 흐름을 필요로하지 않습니다. 흐름이 differentially 등 안정적인 초점 adhesions 작은 초점 단지와 시냅스 26을 형성 대부분의 백혈구와 같은 빠른 마이그레이션 세포를 형성 섬유 아세포로 천천히 마이그레이션 세포에 영향을 미칠 수 있기 때문에 중요합니다. 층류에서 전단 응력은 수용성 신호 27,28에 대한 접착제 신호와 세포 chemotaxis에 세포 접착의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 느린 이동 헬러 세포함으로써 마이크로 유체 설치가 모두 자기편 덜 자기편 세포 유형에 대한 적용을 보여 빠르게 움직이는 J77...

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공개 사항

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우리는 공개 할 상업적 이익이 없습니다.

감사의 글

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저자는 호주 연구 협의회 및 국민 건강과 호주의 의학 연구 협의회에서 기금을 인정하고 또한 감사드립니다 microcontact 인쇄 SU-8 마스터를위한 호주 국립 제조 시설. SHN는 고등 교육 말레이시아 Universiti Sains 말레이시아의 교육부에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
커버글라스 얼룩 아웃핏토마스 사이언티픽8542 E40커버슬립 랙
오븐바인더ED 53 시리즈
실리콘 웨이퍼실리콘 퀘스트708-007보론 도핑 < 100쪽> 웨이퍼, 4 "직경, 500 &mU; m, 단면 광택
GM1070 SU-8 포토레지스트Gersteltec Sarl
SU-8 현상액Gersteltec Sarl
Sylgard 184 경화제다우 코닝
Sylgard 184 엘라스토머 프리폴리머다우 코닝
PLL-PEG-비오틴(20%)SuSos AGPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-비오틴(20%)1 mg/ PBS
FluoresceinSigma46955중 ml PBS
Streptavidin-AlexaFluor350InvitrogenS-112491 mg/ml PBS
Biotin-4-fluoresceinInvitrogenB-13700.03 μ 지/&무; PBS
비오틴-RGDGenScriptSC12080.03 mg/ml의 PBS
Syto 64 RedInvitrogenS-113461 μ PBS
끈적 끈적한 슬라이드 화학 주성 3DIbidi80328
200 &mu의 M; l Greiner 노란색 비스듬한 팁Greiner Bio-One739261
VaselineSigma16415
파라핀 왁스, mp 55-57 ° C시그마327204
나노 eNabler 10 μ m 캔틸레버 BioForceSPT-S-C-10s
이미지 J 소프트웨어National Institute of Healthrsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking pluginFabrice Cordeliè resrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
화학요법 및 마이그레이션 도구Ibidi GmbHwww.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html
중

참고문헌

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