형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

요약

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

초록

세포는 세포 외 기질 및 성장 요인과 같은 수용성 신호의 glycoproteins와 같은 접착제 신호의 높은 농도를 향해 감지하고 마이그레이션 할 수 있습니다. 여기, 우리는 라이브 세포 이미징와 호환되는 마이크로 유체 챔버에 접착제 및 가용성 신호의 반대 그라디언트를 만드는 방법을 설명합니다. 폴리-L-라이신 및 폴리에틸렌 글리콜 (PLL-PEG)의 공중 합체는 유리 coverslips을 패시베이션 및 분자 및 세포의 비 특정 흡착을 방지하기 위해 사용된다. 다음 microcontact 인쇄 또는 딥 펜 리소그래피는 접착제 단서로 biotinylated 펩타이드 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 (RGD)에 포인트를 고정 역할을 passivated 표면에 streptavidin의 트랙을 만드는 데 사용됩니다. 마이크로 유체 장치는 수정 표면에 배치하고 streptavidin 트랙에 접착제 신호 (100 % 0 % RGD에 RGD)의 기울기를 만드는 데 사용됩니다. 마지막으로, 같은 마이크로 유체 장치는 chemoattractant suc의 기울기를 만드는 데 사용됩니다접착제 신호의 기울기의 반대 방향으로 용해 신호로 태아 소 혈청 (FBS)과 같은 H.

서론

감독 세포 이주는 많은 세포의 기본 특성이며, 배아 개발, 감염에 대한 방어와 상처 치유 등 많은 정상적인 생리 과정의 핵심 부분입니다. 또한, 세포 마이그레이션은 또한 혈관 질환, 종양 세포의 전이 및 만성 염증의 ^1,2 등 여러 질병에 눈에 잘 띄는 역할을합니다. 클래식 세포 마이그레이션 상태 동안 - 편광, 돌출부 확장, 부착, 힘 생성 및 후면 철회 형성은 - 일반적으로 ^3,4를 사용할 수 있습니다, 신호 통합 조정하는이 spatiotemporal 메커니즘의 해설이 더 도전했습니다.

세포 외 기질 (ECM)은 세포 접착을위한 기판으로 제공하며, 고유의 화학 ⁵ 물리적 ^여섯 다양성을 통해, 셀 탐색 ^7,8에 대한 방향 신호를 제공합니다. 이러한 접착제 단서 ^9, 수용성 요소 ^10-12 외에도 ^</ 저녁을 먹다> 같은 chemokines 및 성장 요인으로 할 수 chemoattractant 수용체 및 하류 motogenic 신호를 통해 직접 세포 이주를 유도. 현재, 그것은 참여와 유착 수용체 (즉, integrins) 또는 수용체 티로신 키나제의 (RTK)와 같은....

프로토콜

1. PLL-PEG-비오틴과 유리 Coverslips의 패시베이션

이 단계는 그 세포가 microcontract 인쇄 (2 단계-3A) 또는 딥 펜 리소그래피 (단계 3B)로 만든 유리 coverslip의 특정 지역에 준수하고 마이그레이션 있도록 표면을 패시베이션하기 위해 설계되었습니다. 패시베이션를 들어, 폴리-L-라이신 (PLL) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공동 폴리머는 PEG 분자의 20 %가 비오틴 (PLL-PEG-비오틴)에 이식되는 사용됩니다.

1. 유리 coverslips (18mm X 18mm), 100 % 에탄올의 랙에 잠수함을 청소하고 30 분에 sonicating 목욕탕에서 랙을 배치합니다. 공기 또는 질소의 흐름에 따라 유리 coverslips를 말린다.
2. 다음 1 M NaOH의 30 분의 유리 coverslips를 sonicate. 이후 조심스럽게 1.5 L 밀리 Q H ₂ O.로 가득 찬 비커에 랙을 찍어하여 유리 표면을 세정 린스 과정을 신선한 밀리 Q H ₂ O 할 때마다 사용을 세 번 반복합니다. 에 유리 coverslips을 건조60 오븐 ° C.
3. 깨끗한 유리의 장소 반은 부분적으로 H ₂ O.로....

결과

셀 철새 신호를 ²⁵ 통합 방법을 이해하기 위해, 우리는 경쟁 접착제 및 가용성 그라디언트 (그림 1) 환경에서 마이그레이션하는 형광 현미경으로 이미지 셀에 방법을 개발했습니다. 형광 streptavidin과 biotinylated RGD를 포함 접착제 트랙이 microcontact 인쇄 트랙과 딥 펜 리소그래피 (그림 2)로 만들어졌습니다. 성공적인 microcontact 인쇄는 접착제 트랙과 안티 오염 지역 명확하게 (그림 2B) 구별 할 수있는 트랙에서 형광 강도의 라인 프로파일로 표시됩니다. 딥 펜 리소그래피로 인쇄 점 반올림, 성공적인 인쇄 프로세스를 나타냅니다 모양 찢어 지지도 않아요 나타납니다. 표면 화학 및 습도는 인쇄 프로세스의 결과에 영향을 미칩니다. 일반적으로, 더 소수성 표면은, 인쇄 결과수록 좋습니다.

접착제 신호의 기울기인쇄 트랙에 비오틴-4.......

토론

이 프로토콜에서는, 우리는 세포 이주에 대한 화학적으로 수정 표면과 chemoattractant 그라디언트의 효과를 연구하기 (Ibidi에서 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis ^3D) 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 장치를 사용했습니다. 그라디언트는 채널의 길이를 따라 확산에 의해 설립되기 때문에 이러한 마이크로 유체 설정은 흐름을 필요로하지 않습니다. 흐름이 differentially 등 안정적인 초점 adhesions 작은 초점 단지와 시냅스 ^26을 형성 대부분의 백혈구와 같은 빠른 마이그레이션 세포를 형성 섬유 아세포로 천천히 마이그레이션 세포에 영향을 미칠 수 있기 때문에 중요합니다. 층류에서 전단 응력은 수용성 신호 ^27,28에 대한 접착제 신호와 세포 chemotaxis에 세포 접착의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 느린 이동 헬러 세포함으로써 마이크로 유체 설치가 모두 자기편 덜 자기편 세포 유형에 대한 적용을 보여 빠르게 움직이는 J77.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
커버글라스 얼룩 아웃핏	토마스 사이언티픽	8542 E40	커버슬립 랙
오븐	바인더		ED 53 시리즈
실리콘 웨이퍼	실리콘 퀘스트	708-007	보론 도핑 < 100쪽> 웨이퍼, 4 "직경, 500 &mU; m, 단면 광택
GM1070 SU-8 포토레지스트	Gersteltec Sarl
SU-8 현상액	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 경화제	다우 코닝
Sylgard 184 엘라스토머 프리폴리머	다우 코닝
PLL-PEG-비오틴(20%)	SuSos AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-비오틴(20%)	1 mg/ PBS
Fluorescein	Sigma	46955	중 ml PBS
Streptavidin-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	1 mg/ml PBS
Biotin-4-fluorescein	Invitrogen	B-1370	0.03 μ 지/&무; PBS
비오틴-RGD	GenScript	SC1208	0.03 mg/ml의 PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 μ PBS
끈적 끈적한 슬라이드 화학 주성 3D	Ibidi	80328
200 &mu의 M; l Greiner 노란색 비스듬한 팁	Greiner Bio-One	739261
Vaseline	Sigma	16415
파라핀 왁스, mp 55-57 ° C	시그마	327204
나노 eNabler 10 μ m 캔틸레버	BioForce	SPT-S-C-10s
이미지 J 소프트웨어	National Institute of Health		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin	Fabrice Cordeliè res		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
화학요법 및 마이그레이션 도구	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html