방법 논문

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

DOI:

10.3791/50312

⸱

2013년 4월 30일

 , 
1Department of Physiology, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

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이 비디오에서는, 우리는 복잡한 신경 회로를 유지하는 뇌 전체 준비에서 확인 된 하나의 뉴런에서 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 (GnRH의) 신경 세포가 유전자 손상 뇌의 준비 식별을위한 형광 단백질로 태그 된 유전자 변형 물고기를 사용합니다.

초록

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복잡한 행동을 조절하는 신경 회로의 세포 생리학을 이해하는 것은이 작품은 CNS의 신경 회로가 그대로 남아 그대로 뇌의 준비에서 수행 할 수있는 모델 시스템을 사용하여 크게 향상됩니다. 우리는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 (GnRH의) 신경 세포가 유전자 손상 뇌의 식별을 위해 녹색 형광 단백질로 태그 된 유전자 변형 물고기를 사용합니다. 물고기 GnRH의 뉴런의 여러 인구를 가지고 있고, 그 기능은 뇌의 위치와 그들이 1을 표현하는 GnRH의 유전자에 따라 달라집니다. 우리는 유전자 변형 송사리의 손상 뇌 (그림 1B 및 C)를 사용하여 후각 전구에 연결된 터미널 신경 (TN)에 위치한 GnRH3 신경에 우리의 시범 초점을 맞추고있다. 연구는 송사리 TN-GnRH3 뉴런은 중추 신경계에 외부 환경으로부터 정보를 송신기 역할을 neuromodulatory 것을 제안, 티셔츠헤이로 잘 알려진 시상 하부 GnRH1 신경 세포 2, 3을 수행합니다. TN-GnRH3 뉴런의 자발적인 활동 전위 사격 토닉 패턴이 고유의 속성을 4-6, 주파수, 뇌하수체 - 생식선 기능 조절에 직접적인 역할을하지 않는다 어느 것이 conspecifics 2 신경 펩타이드 kisspeptin 5에서 시각적으로 변조된다. 이 비디오에서는, 우리는 TN-GnRH3 뉴런이 어떻게 뉴런을 식별하고 뇌 전체에 자신의 전기 활동을 모니터링하는 방법을 보여 강화 된 녹색 형광 단백질 7에 연결 Gnrh3의 프로모터 부위를 포함하는 유전자를 표현하는 형질 전환 송사리의 안정적인 회선을 사용 준비 6.

프로토콜

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1. 성인 송사리의 두뇌의 해부

  1. 에 침지하여 (그림 1A) 남성 또는 여성 성인 마취 5 ML MS-222 (150 ㎎ / L, 산도 7.4), 아가미의 움직임이 해고되기 전에 중지 한 후 몇 분을 기다립니다. 모든 절차는 캘리포니아 대학교 로스 앤젤레스 캠퍼스의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
  2. 60 mm 직경 페트리 접시에 가위로 아가미의 꼬리 끝에 물고기 식염수에있는 물고기의 목을 베십시오.
  3. 35 mm 직경 페트리 접시에 전송 생선 머리는 반 염수 물고기로 가득 뇌 해부에 대한 머리의 위치 및 보안에있는 우울증이 실 가드와 함께 늘어서있다. 위치 및 곤충 핀으로 머리 등쪽면이 위로를 고정합니다.
  4. 신중하게 잘 가위로 그 주위에 두개골의 지느러미 부분을 잘라 조심스럽게 완전히 척수의 앞쪽 부분을 포함한 뇌의 등쪽 부분을 노출, 집게로 제거합니다.
    5. <리> 미세 팁 집게로 조심스럽게 척수를 들어 올리고 뾰족한 가위로 상호 결합 신경을 절단 : 두뇌의 복부 측면에 뇌신경, 척수 신경, 그리고 시신경, 그리고 앞쪽 부분에있는 후각 신경 뇌.
  5. 물고기 식염수로 가득 신선한 페트리 접시에 완전 해부 두뇌를 배치, 전체 뇌가 어떤 상처 나 구멍없는 (뇌하수체 포함) 그대로 확인하기 위해 현미경으로주의 깊게 확인합니다. 손상된 두뇌가 실험에 사용되지 않습니다.

2. 녹음 회의소 뇌 장착

  1. 시아 노 아크릴 레이트의 작은 방울 또는 녹음 챔버의 중앙에 바늘로 다른 속효성 접착제를 놓고 1cm 약 2 접착제를 확산.
  2. 빠르게 복부면이 위치에 뇌와 접착제 아래로 전송할 수 있습니다.
  3. 이 기록 챔버를 채우고 머리를 덮을 수 있도록 물고기 식염수 1 ML을 추가합니다. 지속적으로 붓는다최소 200 μL / 분의 속도로 통기 물고기 식염수 뇌.
  4. 좋은 팁을 사용하여 조심스럽게 뇌의 녹화 영역의 표면에 수막을 제거 포셉.

3. 전기 생리학

  1. 활동 전위 사격 느슨한 패치 기록
    1. 유리 미세 전극 (MΩ 6-10)은 전극 풀러 (예를 들어 셔터 P-87)를 사용하여 붕규산 유리 피펫 (1B150F-4, 세계 정밀 계측기)에서 생성, 다시 절반 방법까지 느슨한 - 패치 녹음 용액으로 채워져 전극.
    2. 냉각 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 똑바로 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현 배를 통해 TN-GnRH3 뉴런 (그림 1B), 다음 40X 물 침지 목표 (그림 1C)를 찾을 수 있습니다. 그들은 telencephalon 바로 앞쪽에 후각 전구의 복부 표면 또는 근처에 위치하고 있습니다.
    3. 제공하는 비디오 모니터로 전환현미경 실시간 영상 TN-GnRH3 신경 세포 클러스터 (그림 1C)를 찾습니다.
    4. 전극의 끝이 신경 세포 표적 위에 있도록 욕조에 미세 전극을 배치합니다. 가가 막혀, 부드럽게 전극의 끝 표적 신경 세포에 접근하지 않도록 미세 상수 약간의 양압을 적용합니다.
    5. AxoGraph 소프트웨어 및 Axograph 소프트웨어 (액슨 악기)와 앰프 Axoclamp 200B를 사용하여 전압 클램프 모드에서 전극의 저항을 점검하고 모니터링 할 수 있습니다. 당신은 전극의 끝이 신경 세포의 표면과 저항이 약간 변경하는 AxoGraph 디스플레이에서인지 비디오 모니터에서 볼 수있는 경우에 낮은 저항 씰을 만들기 위해 긍정적 인 압력을 해제하고 필요한 경우 약간의 부정적인 압력을 적용 신경 세포 (<100 MΩ).
    6. 전류 클램프 모드로 전환하고 규모를 조정하는 현재의 입력없이 지속적으로 막 전압을 기록전압 및 녹음 필요한 경우의 비율. 데이터가 PowerLab의 소프트웨어 (ADInstruments 주식 회사)에 의해 수집되고 분석됩니다.
    7. 어떤 처리 (그림 2A) 전에 약 5 분 동안 정상 물고기 식염수에 기록 기준선 전기 활동. 약물, 호르몬, 펩타이드 등의 목욕 관류. 물고기 식염수에 추가하는 것은 보통 물고기 식염수 5, 6, 11 유실 뒤에 마침표 200 μL / 분의 속도로 계속됩니다.
  2. 막 잠재력의 전체 세포 녹음
    3.1.4 - 전체 세포 패치 클램프 전기 생리학 절차는 단계 3.1.1에서 설명한 세포 느슨한 - 패치 녹음 절차와 동일합니다. 다음 절차에 따라 편차 :
    1. 전압 클램프 모드에서 전극의 저항을 점검하고 모니터링 할 수 있습니다. 당신은 저항 변화가 약간 긍정적 풀어 전극의 끝이 신경 세포의 표면에와​​ 오실로스코프에서인지 비디오 모니터에서 볼 수있는 경우압력과 신경 (2 ~ 3 기가 Ω)에 높은 저항 인감을 만들기 위해 약간의 부정적인 압력을 적용합니다. 파열 패치 막 입으로 부드러운 흡입을 적용, 당신은 MΩ 약 12​​0-250에 대한 저항의 급격한 저하를 볼 수 있습니다.
    2. 전류 클램프 모드로 전환, 녹화 필요한 경우의 전압과 속도의 규모를 조정하는 현재의 입력없이 지속적으로 막 전압을 기록한다.
    3. 어떤 치료를하기 전에 약 5 분 동안 정상 물고기 식염수에 기록 기준선 전기 활동이 아니라 3.1.7 (그림 2B)에서 설명한.

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결과

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송사리의 절제 뇌에서 GFP - 라벨 TN-GnRH3 신경의 양측 클러스터의 예는 그림의 1B 및 1C에 표시됩니다. 각 클러스터는 8-10 GnRH의 뉴런을 포함하고 있습니다. 대상 TN-GnRH3의 자발적인 신경 활동은 0.5-6 Hz의 전형적인 발사 속도와 전류 클램프 모드 (I = 0)에 기록 하였다. 활동 전위 사격 패턴은 매우 일반적인 interspike 간격으로, 일반적 토닉이나 구타 패턴이다. 샘플 트레이스는 그림 2 (:; 전체 세포 2B 느슨한 패치 2A)에 표시됩니다.

이 실험 방법은 성인 zebrafish의 (그림 3A 및 3B)의 전뇌에있는 GFP - 라벨 GnRH의 신경 세포에서 녹음도 성공합니다. 느슨한 패치 (그림 3C) 및 전체 세포 녹음 (가 송사리에서 설명한대로 ...

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토론

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GnRH의 3 GFP 유전자 변형 물고기는 신경 세포의 통합과 직간접 적으로 재생 3, 8-10에 관여 둘 다 행동의 중앙 제어 규제의 근간이되는 신경 생리 학적 메커니즘을 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이 모델 시스템의 중요한 장점 중 하나는 GFP를 표현하는 많은 GnRH3 뉴런은 신경 회로 6, 9, 11, 12 (그림 방해하지 않고 전기 생리학 기록을 위해 신경을 비교적 쉽게 액세스 할 수 있도록 두뇌의 복부 표면에 가까운 즉 1B 및 1C, 도표 3A 및 3B). 이 비디오에서는, 우리는 송사리의 손상 성인 뇌의 TN-GnRH3 신경 세포 모두에서 느슨한 패치 및 전체 세포 녹음을 보여 주었다. 자연 발화에는 검출 성별 차이는 TN-GnRH3 신경 강장제 0.5-6Hz.There의 주파수로 발사 자발적 활동 전위의 박동 패턴을 전시 않았다...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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우리는 기술 지원을위한 박사 멩 턱 린 양 위안 동 감사합니다. 이 작품은 건강 HD053767의 국립 연구소 (NLW에 하청)에서 교부금에 의해 캘리포니아 로스 앤젤레스의 연구 대학 (NLW)를위한 부총장의 생리학 및 Office의 부서에서 기금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
현미경OlympusBX50W(Upright)
증폭기Axon InstrumentsAxoclamp 200B
A-D 컨버터Computer Interference Corp.Digidata ITC-18
냉각 CCD 카메라PCO 컴퓨터 광학Sensicam
크세논 램프Sutter Instruments Co.
GFP 필터 세트, Chroma Technologies
, 이미징 소프트웨어, Intelligent Imaging Innovations,슬라이드북 소프트웨어
, 전기생리학, 데이터 수집 소프트웨어, Axon Instruments, Axograph 소프트웨어
, 전기생리학, 데이터 수집 소프트웨어,AD Instruments, Inc.PowerLab
전기 생리학을위한 헤드 스테이지Axon InstrumentsCV 203BU
MicromanipulatorSutter Instrument CoMP-285
녹음 챔버 플랫폼Warner Instrument Corp.P1
레코딩 챔버Warner Instrument Corp.RC-26G
전극 풀러서터 기기P87
필라멘트 전극 풀러서터 기기FB330B3.0 mm 넓은 트로프 필라멘트
1.5 mm 유리 모세관세계 정밀 기기1B150-4Micr–
주사기Becton Dickinson309586 3 ml
MS-222 SigmaE10521-10G에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이
염 생선 식염mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 Hepes
전극 용액(느슨한 패치) mM : 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl<이하 >2; 1.3 MgCl<이하 >2; 10 헤페; 10 포도
전극 용액 (전체 세포 패치) mM : 112.5 K- 글루 콘산염; 염화나트륨; 17.5 KCl; 0.5 CaCl<이하 >2; 1 MgCl<이하 >2; 5 마그네슘ATP; 1 에그타; 10 헤페; 1 GTP; 0.1 류펩틴; 10 포스포-크레아틴
트 수 당

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909(2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).

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