마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

요약

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

초록

바이러스 벡터의 Intraparenchymal 주사가 뉴런 또는 중추 신경계의 특정 지역의 독특한 인구에 조건부 유전자 조작을 할 수 있습니다. 우리는 마우스 척추의 등 뿔의 대상으로 유전자 발현이나 입을 수 stereotaxic 분사 기술을 보여줍니다. 수술 절차는 간단합니다. 그것은 동물과 척추 손상되지 않은 운동성의 빠른 복구를 위해 제공하는 하나의 척추 뼈의 laminectomy이 필요합니다. beveled 유리 캐뉼라와 microsyringe의 낮은 속도와 사용의 작은 벡터 정지 볼륨의 조절 주입은 조직 병변을 최소화합니다. 벡터에 대한 현지 면역 반응은 고용 바이러스의 고유 특성에 따라, 우리의 경험으로는, 재조합 adeno - 관련 바이러스가 사용될 때 미성년자 수명이 짧은 것입니다. 이러한 강화 된 녹색 형광 단백질 등의 리포터 유전자는 벡터의 모니터링 공간 배포를 용이하게하고, 효능 및 세포 specitransfection의 ficity.

서론

마우스 조건부 유전자 조작의 고급 기술은 중추 신경계의 신경 경로와 기능 연결의 탐구에 다각적 인 접근을 가능하게합니다. Transgenes은 에스트로겐 수용체 ^(1)의 변이 리간드 결합 도메인을 인식 억제 또는 유전자 전사의 활성화, 또는 tamoxifen으로 작동하도록 설계 할 수있는 테트라 사이클린 제어 transactivator에 행동 등 doxycycline와 같은 작은 분자 effectors에 의해 규제 될 수 있습니다 . 돌이킬 수없는 transgene 수정은 일반적으로 데 옥시 리보 핵산 (DNA) recombinases에 의해 달성된다. Cre (원인 재조합) 및 Flp (flippase 재조합 효소)는 절단, 반전 또는 각각 ¹ loxP (교차로 X의 궤적 이상, P1) 또는 Frt (flippase 인식 대상) 사이트로 둘러싸인 아르 DNA 조각의 translocation을 catalyze. 응용 프로그램은 유전자 활성화 또는 입을과 inducible ribonucleic 산성 (RNA) 간섭을 포함 ^{2. 이러한 β-갈 락토 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 형광 또는 효소 기자 조건부 표현식은 뉴런에 라벨 및 국소 조직과 연결 심사 3하는 데 사용할 수 있습니다. 북미 (의 대규모 mutag....}

프로토콜

설명 수술 절차는 컬럼비아 대학 (Columbia University)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 장비 및 바이러스 입자 현탁액의 준비

1. 장비를 청소하고 소독, 수술기구와 척추 뼈의 L1 문제를 해결하는 데 사용됩니다 V 노치 스파이크를 소독.
2. 당기 및 베벨 유리 피펫. 우리는 40 μm의 팁 직경이 20 °의 각도로 beveled 아르 피펫을 사용합니다. 유리 피펫 멸균을.
3. stereotaxic 프레임을 설정, 머니퓰레이터에 microsyringe 분사기를 장착하고 컨트롤러에 주입기를 연결합니다.
4. 압축 피팅 키트를 사용하여 microsyringe에 유리 피펫 중 하나를 첨부합니다.
5. microsyringe에서 플런저를 제거하고 미네랄 오일과 주사기를 입력합니다. 오일 레드 O (1 - (2,5 - 디메틸-4-(2,5-dimethylphenylazo) phenylazo) -2 - 나프톨은)는 v를 높이기 위해 미네랄 오일에 추가 할 수 있습니다isibility. 플런저를 다시 삽입하고 팁의 모든 방식을 밀어. 조심스럽게 기포를 생성하지 마십시오.
6. 바이오 안전성 캐비닛의 바이러스 입자 현탁....

결과

성공적으로 transfection 수율 contralateral 측면, 배면의 뿔과 등쪽 루트 신경절의 등 뿔을 구해 주신 주입 등쪽 뿔 (그림 1)의 뉴런에 강력한 유전자 표현.

1 그림. 등쪽 뿔 뉴런의 Transfection. (A) L4 척추, rAAV-eGfp의 stereotaxic 주입 후 2 주 (혈청 형 AAV2 / 8 / 10 ⁹ 게놈 사본의 왼쪽 등쪽 뿔에있는 형광 기자 eGfp (녹색)의 표현 ) μl. 뉴런은 neuronal 핵 단백질 (NeuN, 빨간색)을 immunostained되었습니다. 화살표는 등쪽의 항목에 흩어져 transfected glial 세포에 지점을 향합니다. 스케일 바, 150 μm. (B) 내측 등쪽 뿔.......

토론

Stereotaxic 벡터 ^주입은 neurodegeneration ¹¹ 예방 또는 치료에 대한 상해 ^9,10, 또는 유전자 치료에서 재생하는 동안 ^6,7 또는 optogenetic의 해부 ^8, 축삭 안내를 확산 transsynaptic 바이러스에 따라 이러한 neuronal 네트워크 매핑과 같은 응용 프로그램에 대한 척추의 뉴런을 대상으로 할 수 있습니다 ^12. 바이러스 벡터는 somatosensory, 모터 및 자율 경로주세요 ^{9,10,13-15을} 공부하는 척수의 유전자 조작에 사용되었습니다. 마우스는 가장 널리 뇌 또는 척수에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주사를 포함하는 연구에 사용 된 모델 생물이지만, 기술은 nonhuman 영장류 ¹⁶ 등의 다른 종에 채용되었습니다.

마우스 척수로 Stereotaxic 벡.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
재료 이름	회사	카탈로그 번호
척추베이스 플레이트	데이비드 Kopf 악기	912
작은 동물 stereotaxic 악기	데이비드 Kopf 악기	900
마우스 가스 마취 헤드 홀더	데이비드 Kopf 악기	923-B
조정 기본 장착	데이비드 Kopf 악기	982
V 노치 스파이크	데이비드 Kopf 악기	987
작은 동물 온도 제어 시스템	데이비드 Kopf 악기	TCAT - 2LV
Adson 포셉	정밀 과학 도구	11006-12
Laminectomy의 포셉	정밀 과학 도구	11223-20
SYS-Micro4 컨트롤러와 UltraMicroPump (한)	세계 정밀 계측기	UMP3-1
Microsyringe, 65RN	해밀턴	7633-01
RN 압축 피팅, 1mm	해밀턴	55750-01
붕규산 유리 모세 혈관	세계 정밀 계측기	1B100F-4
Microgrinder	Narishige	EG-44