방법 논문

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

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DOI:

10.3791/50316

⸱

2013년 6월 21일

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

초록

이전 연구는 ITSN - 초 (KD ITSN), 폐 혈관 투과성과 내피 세포 (내피) 생존에 의한 세포 사멸 세포 죽음, ITSN - 초 장기와 세포 배양 시스템 개발의 주요 장애물을 조절에 관여 endocytic 단백질의 최저를 보였다 억제 1. 사업자로서 양이온 성 리포좀을 사용하여, 우리는 ITSN-1 유전자 (의 siRNA ITSN) 대상의 siRNA의 전신 투여가 마우스 폐에 ITSN - 초 유전자의 침묵을 탐구. 2 생산, 반복 투여에 안전 nonimmunogenic, 비 독성, 쉬운 : 양이온 리포좀의 siRNA 전달을위한 몇 가지 장점을 제공합니다. 리포솜의 성능 및 생물 학적 활동은 콜레스테롤과 디메틸 dioctadecyl 암모늄 브로마이드 조합을 사용하여 크기, 전하, 지질 구성, 안정성, 용량 및 투여 3의 경로를 여기에, 효율적으로 획득 한 마우스의 폐에서 특정 KD ITSN에 따라 달라집니다. 정맥 배달의 siRNA ITSN의 / 양이온 성 리포좀과의 복합체는 일시적으로 추가 3 일 후에 회수 3 일에서 마우스 폐 ITSN - 초 단백질 발현을 무너 뜨렸다. 반복 안전한 항공사로서 양이온 성 리포좀의 활용, 연구는 24 일 연장했다. 따라서, 갓 생성 된 단지 레트로 궤도 치료 연구 4에 걸쳐 지속적인 KD ITSN을 유도마다 3 일 투여 하였다. 여러 시점 이후의 siRNA ITSN에서 수집 마우스 조직은 폐 내피에서, 만성 KD ITSN의 효과를 평가하기 위해 전자 현미경 (EM) 분석을 실시 하였다. 고해상도 EM 영상은 우리가 폐 혈관 침대에 KDITSN에 의한 형태 학적 변화를 평가 할 수 광학 현미경으로 특성을 비 감지 (내피 장벽 즉, 중단, caveolae의 수 및 대체 수송 경로의 upregulation를 감소). 전반적으로 이러한 연구 결과는 impor에 설립ECS의 기능과 폐 항상성 ITSN-1의 TANT 역할, 생체 내에서의 siRNA - 리포좀 전달의 효과를 설명하면서.

서론

알몸의 siRNA는 세포막을 통과 할 수없는 부정 청구되고, 그것은 혈액에있는 효소, 조직, 세포로 쉽게 저하됩니다. 심지어 안정성을 향상시키기 위해 최근 구조 변경과 함께 투여 후 대상 사이트에서 siRNA의 축적은 매우 낮고 효율적으로 세포 내 자동차는 5 필요합니다. 양이온 성 리포좀 캡슐화 및 효소 분해 6에서 핵산을 보호하여 세포에 DNA / RNA의 큰 조각을 전송하는 잠재적 인 안전 핵산 항공사로 나타났다. 또한, 양이온 성 리포좀은 저절로 따라서 세포 2 유전자 전달을 촉진, DNA / RNA와 상호 작용합니다. 더 최근 리포솜 백신과 저 분자량 약 7을 제공하기 위해 적용되었습니다. 플라스미드 마이크로 RNA-7-표현의 리포좀 전달 폐암 세포 8 표피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 억제제 저항을 극복한다. 을 대상으로 할 때단지는 내피 장벽을 통과하고 간질 9에 extravasate 할 가능성이 있기 때문에 혈관 내피 세포는 정맥 배달이 필수적이다. 다른 기관과 비교하여 폐의 미세 혈관에서 ECS 가장 큰 이해를 가지고 탐욕스럽게 림프절과 Peyer의 패치를 9 다음에 양이온 성 리포좀과 DNA / RNA 복합체를 내면화. 복고풍 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해 siRNA의의 설치류 모델에서 정맥 배송은 심지어 50 ㎎ / ㎏ 10 높은 농도에 무해 입증되었습니다. 게시 된 문헌에서 양이온 성 리포솜의 구성은 지질 정립과 같은 몰 비율이 11, 12에 따라 다릅니다. 백신이나 항 종양 치료 13-15의 전달 단백질의 down-regulation/over-expression을 대상으로하는지, 생체 내 유전자 전달을위한 양이온 리포좀을 사용하여 잠재적 인 응용 프로그램의 광범위한 배열이 있습니다. 기억하는 것이 중요합니다DNA / RNA-세포막 상호 작용의 효율성이 생성 단지와 막 지질 사이의 결합 형태에 의해 규제되는 것입니다. 이 대상 세포막의 프로필에 지질 성분을 맞게하는 특정 세포 유형 6 형질의 높은 속도에 유익하고 결과가 될 수 있다는 것을 제안합니다.

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프로토콜

1. 양이온 성 리포좀 준비

  1. lipososmes 준비에 사용되는 깨끗한 둥근 바닥 플라스크를 압력솥.
  2. 주식 솔루션을 준비 :
    1. - 작은 유리 병을 사용하여 10 ㎖의 클로로포름에 디메틸 dioctadecyl 암모늄 브로마이드 (DOAB)의 200 밀리그램을 녹인다.
    2. - 작은 유리 병을 사용하여 10 ㎖의 클로로포름 콜레스테롤 200 mg의 녹인다.
    3. - 준비 및 100 RNA의 ML / DNA-ASE 무료 증류수에 5 % 포도당을 살균하는 압력솥.
  3. 클로로포름과 둥근 바닥 플라스크를 씻어. 플라스크, 소용돌이 5-10 ML을 추가하고 몇 분 동안 앉아 보자. 항상 알루미늄 호일로 덮여 플라스크를 유지합니다. 플라스크에서 클로로포름을 비 웁니다.
  4. 리포좀의 제조 :
    1. - 둥근 바닥 플라스크에 DOAB 원액 315 μL를 추가합니다.
    2. - 플라스크 콜레스테롤 원액 200 μL를 추가합니다.
    3. - 플라스크에 클로로포름 9.5 ML을 추가합니다ND는 소용돌이로 섞는다.
  5. 37 rotavapor을 설정 ° C 100 분당 회전 수 (rpm) 이상 (100 ~ 120 RPM). rotavapor가 제대로 연결되어 흡입 튜브 물 펌프 진공 제어에 연결해야합니다.
  6. 아르곤 가스 탱크와 rotavapor를 연결합니다.
  7. rotavapor에 플라스크를 부착하고 수욕을 낮추는 전에 최적의 설정을 조정합니다. 반 시계 방향으로 돌려 완전히 아르곤의 첫 번째 밸브를 엽니 다. 항상 먼저이 밸브를 열고 닫습니다. 두 번째 밸브는 플라스크에 부는 아르곤 압력을 제어합니다. 압력은 항상 부드럽게해야한다.
  8. 완전히 침수되지 않고 물을 터치 속도를 설정하는 플라스크에 충분한, 물 목욕 rotavapor을 낮 춥니 다.
  9. 약 10 분, 모든 클로로포름이 증발 될 때까지 기다립니다. 그런 다음 컴퓨터를 중지합니다.
  10. rotavapor 속도와 아르곤 탱크 밸브를 끕니다. 이제 플라스크 제거해야합니다.
  11. 일에 5 % 포도당 2 ML을 추가합니다전자 플라스크 지질을 용해합니다.
  12. 철저하게 모든 지질을 분해하는 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 플라스크의 바닥을 긁어. 필요한 경우 긁힘 후, 두 번째 팁, 1 ML의 끝에서 플라스크에 남아있는 지질을 제거합니다.
  13. 천천히 (15 회전) 플라스크를 소용돌이로 동안 42 ° C의 물을 욕조에 얻은 솔루션을 품어.
  14. 냉수 sonicator 부가 가치세 (VAT)를 입력합니다. 겨우 물을 만지는 개최 플라스크 바닥 적어도 20 ~ 30 분 동안 용액을 초음파 처리.
  15. 물에 잠겨 둥근 바닥이 시간 제로 속도에서 42시 20 분 ° C에 대한 rotavapor의 물을 욕조에 플라스크를 가열한다.
  16. 0.47 미크론 이후, 0.22 마이크론 주사기 필터를 통해 리포좀을 필터링합니다.
  17. 작은 압출기 사용 unilamellar 리포좀 소포의 동질적인 인구를 생성하는 50 nm의 세포막을 통해 리포좀을 필터링합니다.
  18. 에펜 도르프 튜브에 리포좀을 전송하고 얼음에 놓으십시오.

2. 리포좀을 준비 siRNA를 - ITSN-1 단지

  1. 2 ㎍ / μL의 최종 농도 20 mM의 HEPES 및 150 염화 나트륨, 산도 7.4를 포함하는 siRNA를 버퍼에 표적 마우스의 siRNA ITSN을 resuspend을. 혼합 전에 얼음에 보관하십시오.
  2. 2 μg의 RNA (또는 400 nmol의 리포좀 : 100 μg의의 siRNA ITSN) 8 nmol의 리포좀의 비율의 siRNA ITSN 단지 : 리포좀을 준비합니다. 본 연구에서는 RNA / DNA-ASE 무료 에펜 도르프 튜브를 사용하여 갓 준비 리포좀 100 μL에 원액 (50 μM)에서의 siRNA ITSN의 50 μl를 추가했습니다. 혼합물 150 μL의 최대 한 번에 마우스 양자와 복고풍 궤도 주입 할 수 있기 때문에의 siRNA ITSN의 농도가 매우 중요합니다.
  3. 쥐를 주입 기다리는 동안 얼음에 혼합물을 유지합니다.

3. 마우스 레트로 궤도 정맥 주입 (눈 소켓의 내부 각도)

jove_content "> 모든 마우스 실험은 러쉬 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 지침에 따라 승인 하였다.

  1. 50 ㎎ / ㎏ 체중 케타민 5 ㎎ / ㎏ 체중 xylazine (시판 혼합물)의 복강 주사로 마우스를 마취. 동물의 체중과 나이에 따라, 마취 볼륨과 농도를 조정합니다. 연구 결과 마우스에 사용되는 생쥐 6-8 주 이전 CD1 수컷 생쥐이며, 25g의 주위에 무게. 주사기 바늘이 부착 된 투베르쿨린 1 ML의 유형입니다.
  2. 한 손으로 마우스의 귀를 잡고 눈의 내부 각도를 노출면에 마우스를 낮추십시오. 습벽 semilunaris에 중간 목표, 눈을 만지지 마십시오.
  3. 세 축에 45도 각도로 혼합물을 포함 주사기를 들고 눈의 눈물 볏 접근.
  4. 천천히 혼합물을 주입하고 주입 사이드와 복구 마우스를하자. 만약 큰 액체바늘 삽입 장소에서 물방울 형태의 주사기에 다시 바늘, 흡입 액을 철회하고 다시 시도하십시오. 반복 주사가 가장 완벽하게 복구 할 수 있도록, 눈을 교대로 수행됩니다. 모르는 경우,이 기술은 청색 염료 (50 μL, 메탄올 0.5 % 크리스탈 바이올렛) 주입과 푸른 혈관을 관찰하기 위해 마우스 폐를 노출하여 확인할 수 있습니다.
  5. 이 연구에서 쥐가 사망하거나 부작용없이 3 주 동안 매일 3 회 하루 주입 하였다.

4. 생화학 연구를위한 마우스 폐 관류 및 조직 컬렉션

  1. 1.5 ML / 분에 실행되도록 연동 펌프를 설정합니다.
  2. 인공 호흡기, 수술대, 악기, 멸균 면봉, 면봉, 문자열, 비커, 증류수, 행크의 균형 소금, 추적 : 설정을 준비합니다.
  3. 마취 혼합물 (100 ㎎ / ㎏ 체중 케타민을 10 ㎎ / ㎏ 체중 xylazine)를 복강 내 주사로 마우스를 마취.
  4. 목 수준에서 침샘을 제거하고기도를 노출합니다.
  5. 개복술, 소비세 격막과 함께 시작하고, 폐와 심장을 노출, 개흉술에 따릅니다.
  6. 흉선을 제거합니다.
  7. 더 나은 정확도를 위해 광학 현미경을 사용하여 폐 동맥 카테 테르를 꽂다.
  8. 기관 절개술을하고 tracheostoma를 사용하여 마우스를 삽관. 150 스트로크 / 분, 150 μL의 박출량의 비율로 인공 호흡기를 설정합니다.
  9. 출구로, 왼쪽 심방을 엽니 다.
  10. 연동 펌프와 행크의 솔루션을 사용하여 5 분 동안 혈액의 무료 마우스 폐 혈관을 붓는다 37 예열 ° C.
  11. 동일한 유량에서 추가로 10 분 동안 추적 (8 nm의 금 알부민 16) 붓는다.
  12. 행크의 솔루션 5 분 폐 관류하여 언 바운드 추적을 세척하십시오.
  13. 0.1 파이프의 10 분의 4 %의 관류 (중량 / 부피) 포름 알데히드, 2.5 % 글루 타르 알데하이드, 1 % 탄닌산에 의해 폐의 현장 정착에에 따라버퍼, 산도 7.2.
  14. 폐를 수집, 과도한 조직을 제거 작은 블록 (3분의 3 밀리미터) 잘라 고정액 혼합물의 2 ㎖를 포함하는 레이블 섬광 유리 병에 배치합니다.

마우스 절차를 수행하는 동안 완전히 마취 만료됩니다.

5. EM에 대한 마우스 폐 조직 처리

  1. 주식 솔루션을 준비 : 1 % Palade 오소 4 veronal 아세테이트, 및 켈렌 버거 버퍼입니다.
    1. - 1 % Palade-OSO 4 버퍼는 포함한다 : 1 ML 초산 veronal 주식, 1.25 ML 4 % 오소 4 일까지 최종 볼륨 5 ㎖에 0.1 ㎖의 N 염산과 증류수.
    2. - 아세테이트 veronal 원액은 1.15 g 나트륨 아세테이트 andydrous 증류수 100 mL에 바르 비탈 2.94 g을 용해하여 얻을 수 있습니다.
    3. - 켈렌 버거 솔루션은 아세테이트 veronal 주식의 2 ㎖, 0.1 N 염산 0.05 g의 우라 닐 아세테이트 2.8 mL를 5.1 mL를 포함증류수, pH가 6.
  2. 간단히 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 = 7.4, 3 번 폐 블록을 씻으십시오.
  3. 실온에서 1 시간 동안 0.1 파이프 버퍼, 산도 7.2의 4 % (중량 / 부피) 포름 알데히드에 시험편을 고정, 2.5 % 글루 타르 알데히드.
  4. 어둠 속에서, 얼음, 후드에 1 시간 동안 1 % Palade-오스뮴과 후 고정합니다.
  5. 켈렌 버거 버퍼를 한 번 씻어.
  6. 실온에서 하룻밤에 2 시간 동안 켈렌 버거 버퍼의 표본을 품어.
  7. 50 % 에탄올에 한 번 씻어.
  8. 70 %, 95 %, 다음 2 개 15 분 100 % 에탄올 : 에탄올의 등급 시리즈, 5 분 / 각각 탈수.
  9. 100 % 프로필렌 옥사이드, 2 개 15 분으로 전환합니다.
  10. 프로필렌 옥사이드를 제거하고 실온에서, 바퀴 회전, 밤새 품어, 50 %의 프로필렌 옥사이드 및 50 %의 EPON 812의 혼합물을 추가합니다.
  11. 다음날 아침, 혼합물을 제거하고 적어도 바퀴에 4-5 시간 동안 신선한 EPON 812를 추가합니다.
  12. 채워진 두 배 테이퍼 형을 사용하여신선한 100 % EPON 812 절반 방법은 선택된 표본을 추가하고 가장자리에 배치합니다.
  13. 60 ° C에서 인큐베이터 세트에 금형을 이동하고 그들을 48-72 시간 동안 치료하자.
  14. 중합 할 때, 단면 (두께 60 ~ 70 nm의) 얇게 블록을 보낼 수 있습니다.

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결과

ITSN - 초 단백질과 mRNA의 수준은 서양 얼룩과 4에서와 같이 기존의 정량 PCR로의 siRNA ITSN 배달 후 몇 시간 지점에서 관찰되었다. siRNA를 ITSN 처리 쥐의 폐에있는 ITSN - 초 단백질과 mRNA의 수준 21 일 ITSN-1의 연속 최저 동안 컨트롤을 참조하여 약 75 % 감소했다. ITSN - 초없이, dynamin를-2, 세포막에서 caveolae의 박리 ITSN-1과 핵심 선수의 주요 상호 작용 파트너를 효율적으로 endocytic 사이트에 채용되지 않고 세포막 무료 수포 형성에서함으로써, caveolae 분리 캐리어는 1, 17을 발휘할 수있다. 따라서 효과가 막 분열 및 무료 기공을 갖는 캐리어의 손상 형성 부족 이입과 transendothelial 수송, 간 혈관 장벽의 파괴 및 폐 부종 (그림 1)가 발생했습니다. 또한, ITSN-1의 다운 규제를 닫 다른 TR에게 규제ansp...

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토론

우리가 장기적으로 특정 siRNA의 / 리포좀 복합체의 반복 정맥 주사 (연속 24 일 동안 매일 72 시간)에 의해 생체 내에서 ITSN-1의 노크에 대해이 방법을 개발 한 사람 9 우리 1, 18에 의해 출판 이전의 연구에 기초를 두는. 이 실험 방법은 효율적이며 안전하고 반복적으로 사용할 수 있으며, 그것은 쉽게 폐 내피 세포 및 폐 항상성에 대한 관심의 단백질을 코딩하는 유전자의 참여를 공부하도록 확장 할 수 있습니다. 반복의 siRNA / 리포좀 전달을 위해 우리가 설정 한 실험 조건에서, 쥐 독성이나 면역 반응의 표시없이 정상 나타났다. 의 siRNA ITSN / 리포좀 복합체의 전신 투여는 암 및 기타 대사 질환 등의 표시를위한 가장 임상 적으로 관련성이 노선이다. 폐의 siRNA / 리포좀 정맥 주사 단지이가 효율적 KD ITSN을 설명 할 수에서 발견하는 첫 번째 모세관 침대입니다폐있다.

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 작품은 SP에 건강 보조금 R01HL089462의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(DOAB)시그마-알드리치D2779
리포소고속 안정제(미니 압출기)Avestin Inc.LF-STB
폴리 카보네이트 멤브레인, 직경 19mm, 기공 50nmAvestin Inc.LFM-50
콜레스테롤Sigma-AldrichC-8667
클로로포름Mallinckrodt 화학 물질4432-04
Hank's Balanced SaltsSigma-AldrichH1387
둥근 바닥 플라스크Fisher ScientificFHB-275-030X
마우스 siRNAITSN - 표적 Dharmacon/ ThermoScientificJ-046912-11
연동 펌프IsmatecREGLO-CDF 디지털 with RHOO 펌프 헤드
인공호흡기Hugo Sachs ElectronikNA
BarbitalSigma-AldrichB-0500
Uranyl acetateEM Sciences22400
Epon812EM Sciences제조업체에서 단종
프로필렌 옥사이드EM Sciences20400
임베딩 몰드EM Sciences69923-05
탄닌산EM Sciences21710
8nm 골드 알부민 추적자in16
Comments
Avestin 1ml 2개 장착 가스 밀폐 주사기 (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo<
D-79232 March, Germany
Embed812, cat. # 14120으로 대체됨
td colspan="4">IDEX corp의 일부.

참고문헌

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