통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
빠르고 효과적인 진단은 효과적인 환자 관리 및 치료를함으로써 전염병을 제어하는 데 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates의 인플루엔자 바이러스를 증폭 할 수있는 능력을 통합 마이크로 열가소성 칩을 제시한다. 환자 샘플을로드하면, 마이크로 유체 장치는 순차적으로, 온칩 세포 용해, RNA 정화 및 고체 위상 추출 (SPE), 역 전사 (RT) 및 RT-PCR 챔버에서 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 농도 단계를 수행 각각. 엔드 포인트 검출은 오프 칩 Bioanalyzer을 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)를 사용하여 수행됩니다. 이 박막 히터는 RT와 PCR 챔버의 열원으로 사용하는 동안 주변 기기를 들어, 우리는 시약 및 샘플을 늘리기 위해 하나의 주사기 펌프를 사용했습니다. 이 칩은 fabricati을 줄이기 위해 높은 처리량 제조를위한 단일 레이어와 적합하도록 설계되어시간과 비용 있습니다. 마이크로 칩은 관심의 새로운 병원균을 감지하는 데 필요한 시약 디자인의 변화 만 제한 바이러스와 박테리아의 다양한 분석 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.
서론
수백만 명의 죽음은 20 세기 1 세 인플루엔자 전염병 동안보고되었습니다. 또한, 가장 최근의 인플루엔자 유행은 2009 년에 세계 보건기구 (WHO) 2로 선언되었고, 같은 2010년 8월 1일의, 18,449 사망자는 WHO 3보고되었다. 이 유행은 다시 전염성 질병의 높은 부담, 및 빠른 질병 확인, 적절한 공중 보건 대응하고 효과적인 치료 4 활성화 인플루엔자의 신속하고 정확한 탐지의 필요성을 보여 주었다.
널리 독감을 진단에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다, 이들은 빠른 immunoassays 직접 형광 항원 검사 (DFA) 및 바이러스 성 문화 방법이 포함되어 있습니다. 다른 두 방법은 노동 집약적 인 9 소비 시간이있는 동안 급속한 immunoassays은 극적으로, 감도 5-8가 부족합니다. 분자 테스트는 짧은 턴 - 주위에 시간, 높은 sensit 등의 여러 장점을 제공합니다ivity, 높은 특이성. 여러 상업 기관은 전염병에 대한 빠른 분자 테스트 (또한 핵산 검사 또는 NATs이라고도 함)으로 작업되었으며, 몇은 파이프 라인에서 인플루엔자 assays 있습니다. 그러나 대부분은 오프 칩 샘플 준비가 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 칩 제조 12
- Zeonex 690R 알약에서 두 액자 만들기 : 5 분에 198 ° C에서 가열 언론에 금속 플레이트, 예열의 중심에 균일하게 8~9g Zeonex 알약을 배포 한 다음 다른 5 분에 2,500 PSI로 천천히 압력을 적용 할 수 있습니다. 이 단계를 완료하려면, 우리는 카버 핫 프레스를 사용했습니다.
- 에폭시 몰드와 상패의 마이크로 유체 채널을 양각. 금형 제조에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 12 일 (그림 2B의 채널 디자인) 설명되어 있습니다 : 에폭시 몰드에 한 플라크를 넣어 한 후 157에있는 온수 보도에 앞서 열을 가하다 그 ° 10 분에 C와 다른 10 분 동안 천천히 1,000 PSI에 압력을 적용 . 손으로 금형에서 플라크를 제거하거나 아래로 냉각하기 전에 집게를 사용합니다. (참고 :이 단계에서 열 장갑을 착용하십시오.)
- 입구, 폐기물 포트, 그리고 마이크로 유체 채널의 출구에서 양각 칩에 구멍을 뚫는다. 우리는 1.25 mm의 diam를 사용세 구멍을 만들기 위해 드릴 비트를 eter.
- 본드 다른 플라크 (상단)과 양각 칩은 :; 또 다른 350 PSI에 한 다음 Enter 키....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
전형적인 결과는 인플루엔자에 감염된 nasopharyngeal 세척 표본에 대한 그림 3에 표시됩니다. 각 환자 표본에서 인플루엔자 바이러스의 서로 다른 양의로 인해, PCR 제품의 최종 농도는 달라질 수 있습니다. 좋은 결과는 낮은 노이즈, 두 명확 래더 봉우리 (35 10,380 BP)과 긍정적 인 샘플에 대한 설계 제품 사이즈 (107 BP)에서 하나의 제품 피크가 있어야합니다. 제품 피크는 이론적으로 부정적인 컨트롤 결석해야하지만, 우리는 샘플에 프라이머 - dimers 형성에서 독감 별 궤적 근처 가짜 PCR의 봉우리를 관찰 했어요. 여러 제품 봉우리는 시험의 잠재적 인 오염을 반영합니다. 이 경우 샘플의 또 다른 나누어지는이 필적한다. 젤 전기 영동은 시험 결과 13 자세한 확인을 위해 사용할 수 있습니다.
에서 "강한 : SR.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
진단 방법은 높은 특이성과 낮은 검출 한계가있는 환자 표본에서 인플루엔자 RNA를 증폭 할 수있는 통합 마이크로 플라스틱 칩의 능력을 보여 여기에 제시된 13 우리는 케어 테스트의 잠재적 지점이 칩을 설계 :. (A) 온도와 유체 컨트롤이 간단했다, (b)는 칩은 낮은 비용과 사출 성형을 사용하여 높은 처리량 제조에 적합, 그리고 (c) 칩은 따라서 표본 교차 오염의 우려를 줄이고, 종이 및 한 번에 사용하기위한 것입니다.
3 시간 우리의 현재 온 - 칩 런타임 있지만, 추출 플랫폼은 프로세스 최적화를위한 충분한 공간이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 오른쪽 용출 전에 세척 및 건조 시간은 유량 증가 및 세탁 볼륨을 줄일 수의 조합에 의해 감소 될 수 있습니다. 또한, 비용은 칩 제조 공정을 능률화하고 값 비싼 또는 성가신 아름다운 요정을 대체하여 트리밍 할 수 있습니다이러한 일회용 주사기 주입 펌프와 고체 위상 추출 열 기하학과 다공성을 열기 작은.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁 재정 이익을 선언 없습니다.
감사의 글
이 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 R01 EB008268에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 1 dodecanol | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | 애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA | G2943CA | |
| 2 - 프로 파놀 | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 19,516 | |
| Benzophenone | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 239852-50G | |
| BSA | 온도 피셔 과학, pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| 부틸 메타 크릴 레이트 | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 235865-100 ML | |
| 캐리어 RNA | Qiagen, 발렌시아, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 105899-1L | |
| 에탄올 | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | E7023 | |
| 에틸렌 dimethacrylate | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 335861 | |
| 에틸렌 글리콜 dimethacrylate | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 335681-100ML | |
| 유리 주사기 250 μl | 해밀턴, 리노, NV | 81,127 | |
| 구아니딘의 thiocyanate | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 50,981 | |
| 높은 감도 DNA 키트 | 애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA | 5067-4626 | |
| 핫 프레스 | 카버 와바 시가에 | 4386 | |
| JB 용접 Epoxies | Mcmaster-CARR, 허스트, IL | 7605A11 | |
| Luer - 무사히 다녀 오게 주사기 | BD-의료, 프랭클린 호수, NJ | 309628 | |
| 염화 마그네슘 | 온도 피셔 과학, pittsburge, PA | AB-0359 | |
| 메타놀 | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 494437 | |
| 메틸 메타 크릴 레이트 | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch 과학 | N-333-01 | |
| Nanoport 피팅 | Upchurch 과학 | F-120x | |
| Nuclease 무료 물 | 온도 피셔 과학, pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR 키트 | Qiagen, 발렌시아, CA | 210210 | |
| PEG8000 | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 41,009 | |
| 전원 공급 장치 | VWR, Radnor, PA | 300V | |
| 멀리 RNAse | 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | 응용 Biosystems, 포스터 시티, CA | AM7005 | |
| 실리카 마이크로 | Polysciences, 링톤, PA | 24324-15 | |
| 주사기 펌프 | 하버드 장치, Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| 열 전도성 테이프 | Mcmaster - 카, 허스트, IL | 6838A11 | |
| 열전대 | 오메가 공학, 스탬 포드, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| 박막 히터 | Minco, 미니애폴리스, MN | HK5166R529L12A | |
| 자외선 Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon 화학 물질, 루이빌, KY | 690R |
참고문헌
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
