마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

요약

통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.

초록

빠르고 효과적인 진단은 효과적인 환자 관리 및 치료를함으로써 전염병을 제어하는​​ 데 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates의 인플루엔자 바이러스를 증폭 할 수있는 능력을 통합 마이크로 열가소성 칩을 제시한다. 환자 샘플을로드하면, 마이크로 유체 장치는 순차적으로, 온칩 세포 용해, RNA 정화 및 고체 위상 추출 (SPE), 역 전사 (RT) 및 RT-PCR 챔버에서 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 농도 단계를 수행 각각. 엔드 포인트 검출은 오프 칩 Bioanalyzer을 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)를 사용하여 수행됩니다. 이 박막 히터는 RT와 PCR 챔버의 열원으로 사용하는 동안 주변 기기를 들어, 우리는 시약 및 샘플을 늘리기 위해 하나의 주사기 펌프를 사용했습니다. 이 칩은 fabricati을 줄이기 위해 높은 처리량 제조를위한 단일 레이어와 적합하도록 설계되어시간과 비용 있습니다. 마이크로 칩은 관심의 새로운 병원균을 감지하는 데 필요한 시약 디자인의 변화 만 제한 바이러스와 박테리아의 다양한 분석 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

서론

수백만 명의 죽음은 20 세기 ¹ 세 인플루엔자 전염병 동안보고되었습니다. 또한, 가장 최근의 인플루엔자 유행은 2009 년에 세계 보건기구 (WHO) ^2로 선언되었고, 같은 2010년 8월 1일의, 18,449 사망자는 WHO ^{3보고되었다.} 이 유행은 다시 전염성 질병의 높은 부담, 및 빠른 질병 확인, 적절한 공중 보건 대응하고 효과적인 치료 ⁴ 활성화 인플루엔자의 신속하고 정확한 탐지의 필요성을 보여 주었다.

널리 독감을 진단에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다, 이들은 빠른 immunoassays 직접 형광 항원 검사 (DFA) 및 바이러스 성 문화 방법이 포함되어 있습니다. 다른 두 방법은 노동 집약적 인 ⁹ 소비 시간이있는 동안 급속한 immunoassays은 극적으로, 감도 ^5-8가 부족합니다. 분자 테스트는 짧은 턴 - 주위에 시간, 높은 sensit 등의 여러 장점을 제공합니다ivity, 높은 특이성. 여러 상업 기관은 전염병에 대한 빠른 분자 테스트 (또한 핵산 검사 또는 NATs이라고도 함)으로 작업되었으며, 몇은 파이프 라인에서 인플루엔자 assays 있습니다. 그러나 대부분은 오프 칩 샘플 준비가 필요합니다. 분자 검사 검정 카트리지 나 모듈에 샘플 준비를 통합 면제 임상 실험실 개선 개정 (CLIA)의 없음.

랩 - 온 - 어 - 칩 기술은 포인트의 케어 테스트 장치의 개발에 중요한 역할을한다. 1993 ¹⁰ 첫 번째 PCR 칩의 도입 후, 많은 노력 핵산 테스트 칩을 개발에 투입되었습니다. 그러나, 이들의 몇은 하류 증폭과 통합 원유 샘플 준비되어 있습니다.

우리는 이전에 플라스틱 마이크로 칩 ^11으로 견고한 위상 추출 컬럼 (SPE)의 소형화을 입증하고 개발 한연속 흐름 PCR 칩 ¹² ment 및 최적화. 여기, 우리는 임상 진단을위한 단일 칩에 RT와 PCR 단계로 SPE를 통합하고 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates에서 핵산을 증폭하기위한 능력을 평가하는 이전 작업을 확장합니다.

프로토콜

1. 칩 제조 ¹²

1. Zeonex 690R 알약에서 두 액자 만들기 : 5 분에 198 ° C에서 가열 언론에 금속 플레이트, 예열의 중심에 균일하게 8~9g Zeonex 알약을 배포 한 다음 다른 5 분에 2,500 PSI로 천천히 압력을 적용 할 수 있습니다. 이 단계를 완료하려면, 우리는 카버 핫 프레스를 사용했습니다.
2. 에폭시 몰드와 상패의 마이크로 유체 채널을 양각. 금형 제조에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 ^{12 일} (그림 2B의 채널 디자인) 설명되어 있습니다 : 에폭시 몰드에 한 플라크를 넣어 한 후 157에있는 온수 보도에 앞서 열을 가하다 그 ° 10 분에 C와 다른 10 분 동안 천천히 1,000 PSI에 압력을 적용 . 손으로 금형에서 플라크를 제거하거나 아래로 냉각하기 전에 집게를 사용합니다. (참고 :이 단계에서 열 장갑을 착용하십시오.)
3. 입구, 폐기물 포트, 그리고 마이크로 유체 채널의 출구에서 양각 칩에 구멍을 뚫는다. 우리는 1.25 mm의 diam를 사용세 구멍을 만들기 위해 드릴 비트를 eter.
4. 본드 다른 플라크 (상단)과 양각 칩은 :; 또 다른 350 PSI에 한 다음 Enter 키를 누릅니다 10 분 동안 131 ° C에서 가열 언론에 공기 건조하고 예열을하고 IPA, RNAse 거리에 있으며 순서에 탈 이온수로 칩을 씻으십시오 10 분.
5. 입구, 폐기물 및 별도 JB 용접 에폭시를 사용하여 콘센트 포트에 Nanoports를 첨부, 제조업체의 지시 사항에 따라 15-24 시간에 대한 치료.
6. 100 μl nuclease 무료 물 다음에 50 μl RNAse 멀리있는 SPE 채널을 씻어.
7. 접목 솔루션 (3 % w / v를 benzophenone과 메틸 메타 크릴 레이트) 4 μl와 SPE 채널을로드 한 다음 365 나노 미터 UV 파장과 2,000 MJ / cm ² 이하 UV 오븐에 10 분 동안 잠복기로 메타 크릴 레이트를 crosslink. 진공과 잔류 접목 솔루션을 제거합니다. 우리는 벽 진공을 사용했습니다. 최상의 결과를 얻으려면 신선한 솔루션을 사용해야합니다. 그것은 일반적으로 수용하지만,를 저장할최대 일주일 4 ° C에서 준비한 솔루션입니다.
8. 16 % 에틸렌 dimethacrylate, 24% 부틸 메타 크릴 레이트, 42 % 1-dodecanol, 18 %의 cyclohexanol, 1 % 2 - 디메틸 아미노 -4 - (메틸 phenylamino) 페놀을 추가 SPE 열 솔루션을 (모든 V / V %) 확인 사진 기자로.
9. SPE 열 솔루션 (1:1 혼합물을하는)와 같은 실리카 마이크로 솔루션의 동일한 볼륨을 가지고, 완전히 ° C 하룻밤 진공 오븐에 70에서 건조. 폐쇄 뚜껑과 함께 튜브에 활용하여 펠릿을 해봐. 건조 실리카 microsphere 튜브와 혼합 할 소용돌이에 SPE 열 솔루션을 추가합니다.
10. 동일한 채널에 SPE 솔루션 4 μl를로드 한 다음 2.5 분 동안 UV 조사하여 crosslink. 그런 다음 위에 칩을 뒤집어 다른 2.5 분에 비추다. polymerized의 SPE 항목은 불투명 한 흰색 고체해야합니다.
11. 초과 반응물을 멀리 씻어하기 위해 100 % 메탄올 500 μl와 채널을 씻으십시오. 이 페인트는 내부 폴리머 PO를 제거주위 조건에서 건조 할 때 rogenic 용매는이를 SPE 칼럼의 열린 기공 구조를 만드는 두 가지 방법이 있습니다.
12. 열 전도성 테이프 칩의 맨 아래에 두 개의 박막 히터를 부착합니다. 히터의 측면은 변성 및 (그림 1 참조) 별도로 어닐링을위한 다양한 채널의 가장자리를 정렬해야합니다.
13. 죽은 통해 칩에 장소 다섯 열전쌍은 각 칩의 열린 쪽 채널을 (그림 2B 참조) 종료했습니다. 열전대는 언론 운동을 통해이 채널에있어. 테이프는 더 열전대의 위치를​​ 수정하는 데 사용되었다.

2. 고체 단계 추출 방법

1. DEPC - 처리 및 autoclaved 물 (deionized 또는 Millipore-필터링)을 70 % 에탄올의 96 μl를 준비합니다.
2. 25X RNA의 추가 4 μl 한 관에 70 % 에탄올의 96 μl를 확보하고, 별도의 관 100 % 에탄올과 같은 혼합물을 중복.
3. 300 준비다음을 혼합하여 채널 버퍼의 μl : 6 M 구아니딘의 thiocyanate (GuSCN), 2 - 프로 파놀의 150 μl, nuclease 무료 물의 63 μl, 그리고 보안 25X RNA 12 μl의 75 μl.
4. 6 M GuSCN, 2 - 프로 파놀 200 μl 및 보안 12 μl 25X RNA의 100 μl : 혼합하여 용해 버퍼의 312 μl를 준비합니다.
5. RNA 보안을 활성화하려면 10-20 분을위한 60 ° C에서 70 %의 에탄올을 가열, 100 % 에탄올, 채널 버퍼와 용해 버퍼.
6. 마이크로 유체 채널을 평형하려면, 0.8 ML / 시간의 유량에서 SPE 채널을 통해 채널 버퍼를 실행합니다.
7. 물 욕조에서 37 ° C에서 VTM에 테스트 샘플을 빠른 해동하고, 가능한 한 빨리이 해동 될 때 물통에서 즉시 샘플을 제거합니다.
8. 10 분에 13,000 rpm으로 샘플을 원심 분리기 및 용해 버퍼 300 μl로 표면에 뜨는 100 μl를 전송합니다. 1 μg / μl 캐리어 RNA의 6 μl를 추가하여 혼합을 완료합니다.
9. 혼합 할 수 소용돌이, 그리고에 대한 스핀 후5 초는 Luer - 무사히 다녀 오게 한 CC의 주사기로 전체 lysate를로드합니다.
10. 0.8의 유량에서 SPE 채널을 통해 lysate를 실행 ML / 시간.
11. 1 ML / 시간 100 μl of100 %의 에탄올에 이어 70 %의 에탄올 100 μl와 SPE 채널을 씻으십시오. (내보냈되지 않습니다 주사기 팁에 50 μl 죽은 볼륨이 있으므로 실제로는 50 μl의 채널을 통해 진행됩니다.)
12. 0.5 ML 마크의 빈 주사기를 위치 1에서 건조 할 채널을 통해 공기를 밀어 ML / 시간.주세요
13. 0.5에서 바인딩 된 핵산을 elute ML / 시간 및 폐기물 포트에서 nanoport에서 13.5 μl를 수집하는 채널을 통해 nuclease - 무료 물 67.5 μl를 실행합니다. (유체 손실이 주사기 팁과 SPE 채널에 54 μl 죽은 볼륨 때문입니다.)

3. RT-PCR

1. Qiagen OneStep RT-PCR 키트의 시약을 사용하여 공기 건조 단계 (2.12) 동안 RT-PCR 마스터 믹스의 36.5 μl를 준비합니다.
2. RT-PC를로드R은 쓰레기 포트에서 nanoport의 시약 및 RNA와 혼합 다음 50 μl RT-PCR 반응을 얻을 수 : nuclease 무료 물, 4 μl RT-PCR 효소 혼합, 10 μl Q 솔루션, 10 μl1X 하나에 13.5 μl 용출 RNA를 단계 버퍼, 2 μl 25 MM MgCl _2, 1 μl 50 앞으로 μM 프라이머 5'-GAC 미쳤 (다고하더라도) TCC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 μl 50 μM 역 프라이머 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 μl dNTP, 0.75 μl 1.0 % w / V BSA, 0.73 μl PEG8000과 5.02 μl nuclease 무료 물.
3. 부드러운 진공으로 RT 채널 (우리가 벽 진공을 사용)에 RT-PCR 혼합물을로드하고 폐쇄 피팅으로 Nanoport을 봉쇄.
4. 히터 1-35 V를 적용 할 수 있습니다. 히터 1 50 ° C.에 equilibrates 후 30 분 동안 RT 채널에 시약 보관 95에서 히터 하나 equilibrates 후 15 분 ° C.에 대한 RT 채널에 시약 보관
5. 히터 1과 히터 2-50 V 27 V를 적용, 60 & 드에 3 분 정도 또는 히터 1 equilibrates 때까지 기다리g, C 및 히터 2 95에 equilibrates ° C.
6. 0.5 μl / 분의 PCR 채널에 시약을 밀어 넣습니다. 시약은 굴곡 채널을 통해 유동하는 것은 약 20 분 정도 소요됩니다.
7. 샘플 굴곡 채널의 끝 부분에 낸다으로 적절하게 크기 pipettor 및 팁을 사용하여 전원 콘센트에서 PCR 제품을 수집합니다.

4. PCR 제품 검색

1. 우리는 제품을 감지 할 수있는 애질런트 높은 감도 DNA 검사를 사용합니다. 이 테스트는 냉장고에서 테스트하기 전에 30 분 애질런트 높은 감도 DNA 키트를 꺼내 실행하십시오.
2. Bioanalyzer 전원을 켜고 2100 전문가 소프트웨어를 엽니 다.
3. 테스트에 PCR 제품의 1 μl를로드하고 애질런트 프로토콜 (따라 http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent의 %의 20Manual.pdf을 ).
4. 분석하고 데이터를 기록합니다.

결과

전형적인 결과는 인플루엔자에 감염된 nasopharyngeal 세척 표본에 대한 그림 3에 표시됩니다. 각 환자 표본에서 인플루엔자 바이러스의 서로 다른 양의로 인해, PCR 제품의 최종 농도는 달라질 수 있습니다. 좋은 결과는 낮은 노이즈, 두 명확 래더 봉우리 (35 10,380 BP)과 긍정적 인 샘플에 대한 설계 제품 사이즈 (107 BP)에서 하나의 제품 피크가 있어야합니다. 제품 피크는 이론적으로 부정적인 컨트롤 결석해야하지만, 우리는 샘플에 프라이머 - dimers 형성에서 독감 별 궤적 ​​근처 가짜 PCR의 봉우리를 관찰 했어요. 여러 제품 봉우리는 시험의 잠재적 인 오염을 반영합니다. 이 경우 샘플의 또 다른 나누어지는이 필적한다. 젤 전기 영동은 시험 결과 ¹³ 자세한 확인을 위해 사용할 수 있습니다.

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토론

진단 방법은 높은 특이성과 낮은 검출 한계가있는 환자 ​​표본에서 인플루엔자 RNA를 증폭 할 수있는 통합 마이크로 플라스틱 칩의 능력을 보여 여기에 제시된 ¹³ 우리는 케어 테스트의 잠재적 지점이 칩을 설계 :. (A) 온도와 유체 컨트롤이 간단했다, (b)는 칩은 낮은 비용과 사출 성형을 사용하여 높은 처리량 제조에 적합, 그리고 (c) 칩은 따라서 표본 교차 오염의 우려를 줄이고, 종이 및 한 번에 사용하기위한 것입니다.

3 시간 우리의 현재 온 - 칩 런타임 있지만, 추출 플랫폼은 프로세스 최적화를위한 충분한 공간이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 오른쪽 용출 전에 세척 및 건조 시간은 유량 증가 및 세탁 볼륨을 줄일 수의 조합에 의해 감소​​ 될 수 있습니다. 또한, 비용은 칩 제조 공정을 능률화하고 값 비싼 또는 성가신 아름다운 요정을 대체하여 트리밍 할 수 있습니다이러한 일회용 주사기 주입 펌프와 고체 위상 추출 열 기하학과 다공성을 열기 작은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호
1 dodecanol	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	443816-500G
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	196118-50G
2100 Bioanalyzer	애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA	G2943CA
2 - 프로 파놀	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	19,516
Benzophenone	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	239852-50G
BSA	온도 피셔 과학, pittsburge, PA	A7979-50ML
부틸 메타 크릴 레이트	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	235865-100 ML
캐리어 RNA	Qiagen, 발렌시아, CA	1017647
Cyclohexanol	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	105899-1L
에탄올	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	E7023
에틸렌 dimethacrylate	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	335861
에틸렌 글리콜 dimethacrylate	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	335681-100ML
유리 주사기 250 μl	해밀턴, 리노, NV	81,127
구아니딘의 thiocyanate	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	50,981
높은 감도 DNA 키트	애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA	5067-4626
핫 프레스	카버 와바 시가에	4386
JB 용접 Epoxies	Mcmaster-CARR, 허스트, IL	7605A11
Luer - 무사히 다녀 오게 주사기	BD-의료, 프랭클린 호수, NJ	309628
염화 마그네슘	온도 피셔 과학, pittsburge, PA	AB-0359
메타놀	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	494437
메틸 메타 크릴 레이트	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	M55909
Nanoport	Upchurch 과학	N-333-01
Nanoport 피팅	Upchurch 과학	F-120x
Nuclease 무료 물	온도 피셔 과학, pittsburge, PA	PR-P1193
OneStep RT-PCR 키트	Qiagen, 발렌시아, CA	210210
PEG8000	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	41,009
전원 공급 장치	VWR, Radnor, PA	300V
멀리 RNAse	시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO	83931-250ML
RNASecure	응용 Biosystems, 포스터 시티, CA	AM7005
실리카 마이크로	Polysciences, 링톤, PA	24324-15
주사기 펌프	하버드 장치, Holliston, MA	HA2000P/10
열 전도성 테이프	Mcmaster - 카, 허스트, IL	6838A11
열전대	오메가 공학, 스탬 포드, CT	5SRTC-TT-J-40-36
박막 히터	Minco, 미니애폴리스, MN	HK5166R529L12A
자외선 Crosslinker	UPV, Upland, CA	CL-1000
Zeonex	Zeon 화학 물질, 루이빌, KY	690R