Method Article

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

DOI:

10.3791/50327

⸱

June 22nd, 2013

 ,  , 
1Department of Surgery, Section of Urology, University of Chicago, 2Committee on Cancer Biology, University of Chicago

In This Article

Summary

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전립선 암의 개시, 소설과 혁신적인 인체 모델 시스템과 방법을 기본 최초의 분자 메커니즘이 절실히 필요 해명합니다. 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 만능 줄기 세포 인구를 유도하는 사전 전립선 비뇨 동 간엽 (UGSM)의 가능성이 전립선 연구에 강력한 실험 도구입니다.

Abstract

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전립선 암 연구의 발전에 심각한 전립선 질환의 개시를 기본 유전 및 분자 이벤트를 이해하는 우리의 능력을 제한하는 인간의 유래와 호르몬 순진 모델 시스템의 가용성에 의해 제한됩니다. 발암 인간의 전립선을 공부하고 더 나은 모델 시스템을 개발을 목표로, 우리와 다른 배아 쥐 전립선 기질의 고유 한 프로 전립선 유도 가능성의 장점을 가지고 비뇨 동 간엽 (UGSM을)라고했다. 이러한 배아 줄기 세포와 같은 특정 만능 세포 인구와 재결합 할 때, UGSM은 남성 호르몬 의존적으로 정상적인 인간의 전립선 상피의 형성을 유도합니다. 이러한 인간의 모델 시스템을 조사하고 실험적으로 일반적인 설치류 형질 전환 연구에 비해 가속 속도로 후보 전립선 암 감수성 유전자의 능력을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는) 유전자의 문화저기서에서 수정 될 수 있기 때문에조직 재조합하기 전에 G의 유도 유전자 발현 또는 siRNA를 노크 다운 벡터, 같은 모델은 유전자의 기능 결과를 테스트 용이하게하거나 촉진하거나 발암 방지하기 위해 생각되는 유전자의 조합.

UGSM 세포의 순수한 인구를 분리하는 기술은, 그러나, 도전과 자주 학습 이전의 전문 지식을 갖춘 사람이 개인적으로 가르 칠 수 있어야합니다. 또한, 면역 호스트의 신장 캡슐 아래 세포 혼합물의 접종은 기술적으로 도전 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 개요와 쥐의 배아와 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 조직 혼합물의 신장 캡슐 주입에서 UGSM의 적절한 차단을 보여줍니다. 이러한 접근 방식은 현재 단계에서 배아 줄기 세포의 xenografting 생체 내에서 필요하며 미래의 응용 프로그램은 잠재적 생체 선 형성 또는 유도 된 pluripotent 줄기 세포 인구 (유도 만능)의 사용을 포함 할 수 있습니다.

Introduction

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전립선 암의 더 나은 인간의 모델 시스템에 대한 엄청난 필요가있다. 특히, 유전자 직접 전립선 암의 개시에 특정 유전자의 역할을 식별하는 조작 할 수있는 일반적인, 비 악성 전립선 조직의 관련 인간의 모델 시스템은 매우 유익한 것입니다. 게놈 시대의 도래는 암 형성에 역할을 할 수 많은 유전자를 발견했다. 실험 인간의 모델 시스템의 부족은, 그러나, 심각한 기능적 테스트 후보 전립선 암 감수성 유전자를 특성화하는 능력을 손상. 이상적인 모델 시스템은 적절한 형질 전환 설치류 모델 시스템과 함께 암 감수성 유전자의 신속하고 더 빠른 기능 분석을 용이하게한다. 또한, 이러한 인간의 모델 시스템에 대한 새로운 치료법의 발견 및 검증을 향해 발암 전립선의 신호 메커니즘을 분자 특성을 가능하게 할전립선 암의 형성을 방지합니다.

인간 배아 줄기 세포 (hESCs에) 이종 이식으로 인간의 전립선 조직을 형성 할 수있다. 2006 년 테일러 등은. hESCs는이 8-12주의 기간 내에 설치류 비뇨 동 간엽 (UGSM)와 다시 결합 될 때 생체 내에서 전립선 상피 세포를 형성하도록 유도 될 수 있음을보고 하였다. 1이 연구에 의해 이전 작업을 기반으로 한 그 쥐 배아 UGSM을 보여주는 쿤하의 연구소는 ....

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Protocol

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이 연구는 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 엄격 수행 하였다. 프로토콜은 시카고의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 (IACUC 프로토콜 번호 72066 및 72231)에 의해 승인되었다. 모든 수술은 마취하에 수행되었으며, 모든 노력은 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다. 인간 배아 줄기 세포주 WA01 (H1, NIH 등록 # 0043)를 mTeSR1 미디어를 사용하여 장치에 독립적 인 프로토콜을 사용하여 WiCell (매디슨, WI) 배양에서 획득 된 (세포 기술을 줄기, 밴쿠버, BC). ES 세포는 해동 10 구절에서 사용되었다.

1. 마우스 또는 쥐 배아에서 비뇨 부비동의 분리

  1. 5 분 동안 CO 2의 흡입에 의해 시간 초과 임신 한 쥐 (일 17.5) 또는 쥐 (일 18.5)를 안락사. 죽음 쥐의 생체 신호의 중단에 의해 확인된다. 다음 인도적의 목을 부러. R시는이 시점에서 안락사 있습니다. 복부 피부와 측면을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 스프레이. 복부 피부와 근육 레이어를 절단하고, 자궁을 잘라 양막 낭에서 쥐의 배아를 분리하고, 탯줄을 잘라. 얼음처럼 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에....

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Results

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테일러, 외.에 의해 흥미로운 보고서에 건물, 우리의 실험실은 일반적으로 사용되는 H1 (NIH 지정한 WA01, 유 전적으로 남성) 인간 배아 줄기 세포주 1.이 라인은 엄격한 품질 관리를위한 시험되고 사용 engrafting 프로토콜을 개발했습니다 karyotypically 정상 13 적절하게 배양 할 때, HES 세포가 확장, 유지 및 피더 무료 문화 방법 (줄기 세포 기술을 통해 상업적으로 이용 가능한 장치가없는 시스템, 밴쿠버 BC)를 사용하여 미분화 및 만능 상태에서 냉동 보존 할 수 있습니다. 14. 우리는 프로토콜은 E18 쥐 UGSM의 단일 세포 현탁액과 함께, 성인 남성 면역 생쥐의 신장 캡슐 아래에 주입 hESCs는 단일 세포 현탁액을 사용합니다. hESCs는이 UGSM 양식 큰 기형 (그림 2B)없이 이식하면서 중요한 컨트롤로, USGM, 아무 식별 성장을 산출하지 만 이식. 15 .......

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Discussion

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UGSM를 사용하여 조직 재조합 전립선의 개발과 전립선 암의 개시에 이르는 분자 사건을 조사하기 위해 매우 유용한 기술입니다. UGSM의 유도 가능성은 전립선 연구에 많은 응용 프로그램에 사용되어왔다, 이러한 강화 종양 기질 - 상피 상호 작용을 공부하고, 종간 전립선 재조합을 형성, 전립선 세포 라인과 종양 걸릴 포함 UGSM의 7,17-20 적절한 준비. 그러나, 설치류 상피 세포를 오염하는 선의 형성에 발생하고 결과를 혼동 할 수있는 실험의 성공에 매우 중요합니다. 따라서, UGSE에서 UGSM의 분리 (단계 2.4) 지금까지 프로토콜도 가장 중요하고 가장 복잡한 단계이다. 이러한 오염 제어하는​​ 종 분별하는 기술의 사용을 강력하게 권장뿐만 아니라,있다 cellula를로부터 선의 형성을 문서화하지 혼자 UGSM를 사용하여 추가 실험 암R 오염 물질 12.

피더 무료 건강의 배양 시약 및 방법의 최근 발전은 순수한 인구 HES 세포.......

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Disclosures

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저자는 작품 발표와 이익에 대한 갈등이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 박사 Arieh Shalhav에 의해 주도 비뇨기과 시카고 섹션의 대학 및 Urologic의 연구 박사 캐리 스케이트 타는 사람 - 쉐퍼가 상대역과 베드신의 이사의 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 박사 미셸 르 보에 의해 주도 시카고 종합 암 센터 (UCCCC) 대학의 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 박사 마크 린겐에 의해 주도 인체 조직 자원 센터의 핵심 시설, 레슬리 마틴과 메리 조 Fekete의 도움으로 전문적인 기술 지원을 감사하는 데. 우리는 또한 테리 리에서 운영하는 면역 핵심 시설을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 외과 시카고 교실, 비뇨기과 섹션의 대학에 의해 투자되었다; 미국 암 협회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (ACS-IRG, # IRG-58-004), 암 센터 지원 그랜트 (P30 CA14599) Brinson 재단 앨빈 바움 가족 기금, 시카고 암 연구 재단 여성위원회의 대학, S. Kregel이 HHMI에 의해 지원됩니다 : 메드 -에 - 졸업생 휄로우엉덩이 (56006772)와 암 생물학 교육 그랜트 (T32-CA09594). 마지막으로, 우리는 원고의 비판적 평가를 위해 로버트 클라크, 박사 VenkateshKrishnan, 나단 Stadick에게 감사의 말씀을 전합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
행크' s 평형 염 용액 (HBSS)GIBCO14170
DMEM/F12GIBCO11330
R1881Sigma965-93-5에탄올 1 ug/ml에 혼합 (1,000x 재고)
NEAAGIBCO11140
펜-스트렙 용액GIBCO15070100x 재고
MatrigelBD Biosciences354230
KETASET (케타민 염산염) Fort Dodge Animal HealthNDC 0856-2013-01100 mg/ml; 멸균 식염수
AnaSed (자일라진) VET-A-MIX, Inc.NADA 139-23620 mg/ml; 멸균 식염수
TrypsinBD Biosciences215240
Collagenase SigmaC2014
Ketoprofen Fort DodgeNDC 0856-4396-01100 mg/ml; 멸균 식염수 Altalube 눈 연고에 1:1,000 희석
Altaire Pharmaceuticals, Inc.NLC 56641-19850
Leica MZ16 F 실체현미경Leica모든 좋은 해부 스코프를 사용할 수 있습니다.
Vannas 스프링 가위Fine Science Tools15001-08
주사기Hamilton84855
Hamilton 바늘, 소형 RN, 28 게이지, 0.5인치, 포인트 스타일 #3 (Blunt)Hamilton7803-02맞춤형 바늘
에탄올 준비 패드Fisher Scientific06-669-62
멸균 거즈 패드Fisher Scientific22-415-469
Ethicon Vicryl 봉합사 (4-0 FS-2)MedVet InternationalJ392H니들인, 용해성 봉합사
Autoclip 9mm 상처 클립Becton Dickenson427631
PVP 요오드 준비 패드Fisher Scientific06-669-98
끝이 뭉툭한 해부 가위Fine Science Tools14072-10
Dumont 미세 팁 집게Fine Science Tools11252-50
가위가 있는 바늘 홀더Fine Science Tools12002-14
에 1:10 희석

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
  2. Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in u....

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