고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.
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이 논문에서
요약
초록
피부 펀치 생검은 일반적으로 말초 신경 병증 1,2의 진단 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 데 사용됩니다. 현재, 그것은 말초 다리 (DL) 및 길이에 따라 polyneuropathies 3의 평가를위한 근위 허벅지 (PT)에서 3mm 피부 생검을 수집하는 것이 일반적 관행이다. 그러나 IENFs의 다각적 인 특성으로 인해, 2 차원 (2D) 영상의 분석을 통해 신경 구조를 중복 검사하는 도전이다. 또한, 입체 (3D) 영상이 딜레마에 대한 더 나은 솔루션을 제공 할 수 있습니다.
현재 보고서에서, 우리는 고통스러운 신경 병증 (PN)을 연구하는 3D 이미지를 적용하는 방법을 제시한다. IENFs를 확인하기 위해 피부 샘플은 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬 신경 세포 마커의 면역 형광 분석을 위해 처리됩니다. 현재, 그것은 IENFD을 억제하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 표준 방법입니다브라이트 현미경 4를 사용하여 PGP의 면역 조직 화학 염색에 의해 채굴. 현재의 연구에서는, 우리는 PGP를 사용하여 총 IENFD를 식별하기 위해 이중 면역 형광 분석을 적용하고, 통각 IENF, 신경 성장 인자 5 (TRK), 높은 친화력 수용체 트로포 마이 오신 수용체 키나제 인식 항체의 사용을 통해. PGP와 TRK 항체 공동 염색 IENF의 장점은 명확 PGP 양성, 통각 섬유를 염색 PN의 연구를 혜택을 제공합니다. 이 형광 신호는 PN과 관련된 IENF의 통각 IENFD 형태 학적 변화를 확인하기 위해 정량화 할 수있다. 형광 이미지는 공 촛점 현미경에 의해 인수 및 3D 분석을 위해 처리됩니다. 3 차원 영상은 더 PN과 관련된 형태 학적 변화를 분석하는 회전 능력을 제공합니다. 함께 촬영, 형광 공동 염색, 공 촛점 이미징 및 3D 분석은 명확 PN의 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다.
서론
현재, 작은 섬유 신경 병증 3, 6-8를 진단하는 데 사용할 수있는 피부 펀치 생검에서 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 의사에 대한 일반적인 방법입니다. 생검은 말초 다리 (DL), 외측 복사뼈 위 10cm, 그리고 근위부 허벅지 (PT), 전방 장골 척추 9 아래 20cm에서 가져옵니다. 모든 IENF는 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬의 연결 마커 10-12을 사용하여 레이블이 표시됩니다. 현재, 그것은 표준 사용하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 방법 브라이트 현미경 6 PGP 염색에 의해 결정 IENFD.입니다 또한 여러 연구 그룹은 PGP 면역 7-9에 대한 면역 형광 프로토콜을 사용했습니다. 작은 섬유 신경 병증은 일반적으로 신경 병증 성 통증과 연관됩니다. 또한 통증 처리를위한 필수 IENF의 역할을 이해하기 위해, 우리는 고통을 생성 섬유와 공동 레이블을 총 IENF하는 기술을 개발했다. Nocicep특히 Aδ TIVE IENF 및 C 섬유는, PGP와 IENF의 공동 레이블과 통각 마커, 트로포 마이 오신 수용체 키나제 A (TRK) 5를 통해 공부하실 수 있습니다. TRK A는 통각의 발전을 위해 필수적인 ....
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프로토콜
부품 번호 : 면역
배경 염색 펀치 피부 생검의 96 - 웰 플레이트 및 예방의 준비는 인간의 과목에서 수집 및 정착액 솔루션에서 12-24 시간 (2 % 0.75 M L-라이신 솔루션 (산도 7.4)와 파라 포름 알데히드와 0.05 mM의 나트륨과 요오드)에 대한 배양하는 4 ° C에서 앞에서 8을 설명했다. 샘플은 다음 다음 설치 미디어를 최적의 절삭 온도 (월), 그라 이오 스탯에 50 μm의 두께 섹션으로 절편에 포함, 최대 1 주일에 대해 4에 20 % 글리세롤 ° C와 생리 식염수 (PBS)를 버퍼 인산염 동결 방지합니다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 하나의 96 - 웰 플레이트에서 자유 부동 면역을 받아야 피부 섹션의 최대 수를 가능한 8 피부 섹션을 위해 설계되었습니다.
DAY 1 :
1. 각질층의 비 특정 면역 반응성의 예방
- 라벨 96 - 웰 플레이트 그림 1과 같이.
- 이미지-IT 96 - 웰 플레이트의 행 1에 각 우물에 배경 염색 11,12을 차단하는 효과 FX 신호 (이미지-IT)의 150 μl를 추가합니다. ....
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결과
우리는 PN 환자에서 PT와 DL 피부 생검에서 IENF의 형태를 연구하는 현재의 프로토콜을 적용했다. 피부는 3 과목에서 PN과 관련된 pathomorphology을 보여 유타 대학에서 수집되었다. 주제는 다음과 같습니다 : 사례 1 : 제 2 형 당뇨병 (: 15 달; 통증 점수 : 지속 시간 51)의 PN의 역사를 가진 51 세 남자 사례 2 : PN의 역사를 가진 56 세 남성 및 사례 3 : 제 2 형 당뇨병 (: 42 달; 통증 점수 : 지속 시간 46)의 PN의 역사를 가진 66 세 남자, 2 형 당뇨병 (:; 47 통증 점수 1백8개월 기간)의. 정량적 감각 검사와 신경 전도 연구 등의 신경 학적 역사와 검사는 말초 신경 병증을 평가하기 위해 수행되었다. 통증 점수는 0-100 시각 아날로그 통증 척도에 따라 결정되었다.
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 인간의 피부에 IENFs (그림 2)의 3 차원 구조를 연구 할 수 있습니다. .......
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토론
IENFD의 측정은 널리 말초 신경 병증 13,14의 정도를 결정하는 데 사용되었다. 현재 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜은 표피의 기저막을 통과 신경 섬유의 밀도를 측정, 그것은 고려 축삭 분기 및 / 또는 신경의 형태 학적 변화를 고려하지 않습니다. 또한, 현재 IENFD 분석 PN 15 고통의 존재와 IENFD 상관 관계를 보여되지 않았습니다.
우리는 이전에 통각 IENFD의 증가 숫자는 DB / DB 생쥐의 통증 행동, 제 2 형 당뇨병 5의 마우스 모델과 연관되어 있다고보고했다. 해당 보고서에서는 먼저 통각 IENF을 연구하는 이중 면역 형광 프로토콜을 적용했다. 현재의 연구에서는, 우리는 PN 환자에서 인간의 피부에 우리의 프로토콜을 확장합니다. 이중 면역 형광 분석 중재 IENFs의 집합 총 IENF 및 통각 IENF 모두 측정을 제공합니다고통. 이러한 통각 IENF는 TRK 및 기타 통각 신경 펩타이드.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다 수 있습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 보조금 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08 NS061039-01A2, 신경 연구 및 발견, 미시간 대학의 A. 알프레드 터 브먼 의학 연구소의 프로그램입니다. 이 작품은 형태와 당뇨병과 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소의 건강 그랜트 5P90 DK-20572 국립 연구소에 의해 자금 미시간 당뇨병 연구 및 교육 센터의 이미지 분석 코어를 사용했습니다. 저자는 통각 바이오 마커 면역 기술의 초기 개발을 지원하기 위해 인간의 피부 샘플을 자신의 관대 한 기부에 대한 로빈슨 싱글과 고든 스미스 (유타 대학) 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | 1X PBS |
| Image-IT FX 신호 | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| 단백질 유전자 제품 9.5 (다클론 토끼) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R& D 시스템 | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 당나귀 &알파;-토끼 | Invitrogen | A21206 | AF488 당나귀 &알파;-염소 |
| Alexa Fluor 647 당나귀 &알파;-염소 | Invitrogen | A21447 | AF647 당나귀 &알파;-염소 |
| 알부민, 소 혈청 | 시그마-알드리치 | A7906-100 | BSA |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T9284 | TX-100 |
| 보정되지 않은 루프 | LeLoop | MP 199025 | 접종 루프 |
| 96웰 분석 플레이트 | Corning Incorporated | 3603 | 웰 플레이트 |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| 현미경 커버 유리 22x22mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher 과학적인 | 12-550-15 | 현미경 슬라이드 |
| 올림푸스 플루오뷰 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | 올림푸스 | FV500 | 컨포칼 현미경 |
| 최적 절단 온도 | 사쿠라 | 4583 | OCT |
| 라이카 저온 유지 장치 | 라이카 | CM1850 | 저온 유지 장치 |
참고문헌
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis
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재인쇄 및 허가
