세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

요약

세포 내 칼슘 ^{2 +} 역학 정자 생리학 및 캘리포니아에 매우 중요하다 ^{2 +} 민감한 형광 염료를 연구하는 다양한 도구를 구성합니다. 인구 실험 (fluorometry 및 흐름 fluorometry 중지) 및 단일 세포 실험 (유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징) 시공간적 [CA를 추적하는 데 사용됩니다 ^{2 +] 변경됩니다.}

초록

정자, 특히 도달 인식하고 계란 융합 디자인 남성의 생식 세포 수 있습니다. 이 작업을 수행하려면, 정자 세포는 끊임없이 변화하는 환경에 직면하고 여러 개의 물리적 장벽을 극복 할 준비를해야합니다. transcriptionally 및 translationally 침묵하는 본질이기 때문에, 이러한 운동성이있는 세포는 방향 자체에 다양한 신호 전달 메커니즘에 깊이 의존하고 지시 패션에서 수영을하고, 계란을 찾기 위해 자신의 여행을하는 동안 환경 조건을 도전에 맞설 수 있습니다. 특히 칼슘 ^{2 +} - 매개 신호는 여러 정자 기능에 필수적이다 : 운동, capacitation (첨 반응 정자를 준비하는 복잡한 과정)과 첨 반응 (정자 - 난자의 융합을 할 수 exocytotic 이벤트)의 활성화. 이 이온의 세포 내 변화를 추적 할 수있는 형광 염료를 사용하는 응용 프로그램, 감도의 용이성으로 인해 현저한 중요성과 DET의 다양성ection. 하나의 염료 로딩 프로토콜을 사용하여 우리는 정자의 칼슘 ^{2 +} 역학을 모니터링하는 네 가지 형광 기술을 사용합니다. 각 기술은 모두 하나의 세포와 세포 인구 수준에서 데이터를 생성, 공간 및 / 또는 시간적 해상도를 가능하게 독특한 정보를 제공합니다.

서론

칼슘 ^{2 +} 진핵 세포의 신호 전달 경로의 보편적 인 두 번째 메신저이다. 내 Ca ^{2 +은} (칼슘 ^{2 +} _I) 흥분과 비 흥분성 세포 모두에서 많은 근본적인 생리적 인 과정의 조절에 참여하고 있습니다. ^칼슘의 중요성과 보편성 ⁺ 두번째 메신저와 같은 신호 전달 이벤트 기간 동안은 세포 내에서 정보의 전송에있는 그것의 시공간적 다양성에서 파생됩니다. 칼슘 ^{2 +} 드 노보 또는 세포의 세포 내 농도 ([칼슘 ^{2 +]} _i) 내에서 분해 합성 할 수없는 서로 다른 세포 지속적으로 버퍼, 격리한다는 구획화하는 메커니즘 및 /를 통해 매우 엄격한 한계 내에서 유지되거나 ^칼슘을 축적하는 동안 ^+. 이 이온의 농도의 변화는 세포 ^{1 ~} 매우 지역화 된 지역에서 발생하고 그러한 변동을 해독하는 데 확보를 위해 필수적입니다 수 있습니다신호 메커니즘 (1) 자신의 역할, (2) 자신의 생리적 중요성 및 세포 신호 (3) 일반 기계 장치의 EPER 이해. 칼슘 ^{2 +} - 매개 신호 정자 ^생리학이 특히 중요하다. 정자의 운동....

프로토콜

본 논문에서는 측정하는 네 앞서 언급 한 기술의 사용보고 [칼슘 ^{2 +]} _나는 인간의 정자 세포의 변화.에게 그것은 잘이 스테로이드는 일시적 [칼슘 ^{2 +]} _나는 정자의 증가를 생산하는 설립으로 우리는 칼슘 ^{2 +} 반응을 유발하는 호르몬을 사용했다. 특히, 인간의 정자에 프로게스테론 직접 정자 세포 ^10,11의 플라즈마 막에 독점적으로 표현 칼슘 ^{2 +} 채널 (즉 CatSper)를 활성화합니다. 우리는 또한 측정 휴식 [칼슘 ^{2 +]} _나는 그것은 또한 널리 증가 [칼슘 ^{2 +]} _나는 capacitation시 발생하는 허용됩니다 주어진 capacitation 전후.에게 최소 형광 값을 위해, 우리는 형광 해소 ^+하는 망간 ^{2를 사용하여,} 양성 대조군을 필요로하는 기술을 위해 우리는 ⁺ 이온 운반체-ionomycin -하는 세포로 최대 칼슘 ^{2 +} 흡수를 유도하고, 따라서, 최대한의 형광 반응 ^{칼슘 사용}.

1. 스 윔업 방법으로 정자 샘....

결과

그림 1. 스 윔업 방법으로 정자 샘플 준비를위한 실험 프로토콜입니다. 운동성 정자의 분리와 그 농도 조정을위한 주요 단계의 개략적 인 다이어그램이 설명된다. capacitation이 필요한 경우 마지막 부화 단계는 수행됩니다.

토론

세포 내 신호는 대부분의 세포 활동을 위해 매우 중요합니다, 칼슘 ^{2 +} 수명주기의 끝에, 수정의 기원에서 자신의 전체 수명에 걸쳐 포유 동물 세포와 함께 유비쿼터스 메신저이다. 다른 자극에 대한 응답으로, [칼슘 ^{2 +]} 나는 증가, 발진 및 시공간적 화와 감소, 따라서, 다양한 프로세스가 활성화됩니다, 변조 또는 칼슘 ^{2 +} 인코딩 메시지가 종료되었습니다. 내 Ca ^{2 +이} 이온 신호 전달 과정의 복잡한 오케스트레이션에 포함되는 역학, 정자의 생리에 매우 중요하다. 이러한 ^칼슘의 지식 ⁺ 변동 해독 칼슘 ^{2 +} 참여 채널, 뚜렷한 신호 계곡에서의 특정 역할의 분자 식별 할 수 있습니다. 칼슘 ^{2 +에} 민감한 형광 염료는 민감도와 특이도가 매우 높은 칼슘 ^{2 +} M을 가능하게 그들을 연구하는 강력한 도구를 구성살아있는 세포의 농도 변화를 추적하는 데 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	A-7906
염화칼슘 이수화물 약. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 바이알/50 μ g 각
이오노마이신	알로몬	I-700
프로게스테론	시그마-알드리치	P0130
염화나트륨	시그마-알드리치	S-9888	인간 정자 배지(HSM)용 시약
염화칼	시그마-알드리치	P-3911	인간 정자 배지(HSM)중
탄산나트륨	JT 베이커	3506	시약 인간 정자 배지 (HSM) 용염화
마그네슘	Sigma-Aldrich	M-2670	인간 정자 배지 (HSM) 용 시약무
수 염화칼슘	Sigma-Aldrich	C-1016	인간 정자 배지 (HSM) 용 시약
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	인간 정자 배지 (HSM) 용 시약
D-Glucose	JT Baker	1906-01	인간 정자 용 시약 매체 (HSM)
나트륨 피루브산	시그마-알드리치	P-2256	인간 정자 배지 (HSM) 용 시약
나트륨 L- 젖산 나트륨 (약 99 %)	시그마-알드리치	L-7022	인간 정자 배지 (HSM) 용 시약프로
피듐 요오드	인비트로겐	L-7011	구성 요소 B
트리톤 X-100 (t-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올)	시그마- 알드리치	X-100	2.4 mM 용액 물 속에서
원형 커버 슬립	VWR	48380 080	25mm 직경
폴리 -L- 라이신 용액	Sigma-Aldrich	P8920
염화망간	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; 세포 챔버, 현미경 검사용	Life Technologies	A-7816
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치	D2650	5x5 ml

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