방법 논문

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

DOI:

10.3791/50389

⸱

2013년 5월 6일

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 섬 항원 특정 기본 CD4 + T 세포의 입양 전송하여 두 주 이내에 생쥐에서 제 1 형 당뇨병 (T1D)를 유도하는 재생 방법을 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

nonobese 당뇨병 (NOD) 마우스 자발적 연령 12 주 후에 면역 당뇨병을 개발하고 인간 1 형 당뇨병 (T1D)의 가장 광범위하게 연구 동물 모델입니다. 조사받는 생쥐의 세포 이동 연구는 T 세포가이 모델 T1D 발병에 중요한 것을 설립했다. 우리는 빠르게 정화의 입양 전송에 T1D 유도하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명, 기본 CD4 + NOD.SCID받는 생쥐에 섬 특정 T 세포 수용체 (TCR) BDC2.5위한 형질 전환 전 당뇨병 NOD 생쥐에서 T 세포. 이 기술의 주요 장점은 같은 일 이내에, 수신자의 조사가 필요하지 않으며 T1D의 높은 발병률이 T 세포 전송 후 2 주 안에 이끌어됩니다 diabetogenic T 세포의 분리 및 입양 전송이 완료 될 수 있습니다. 따라서, T1D의 병인과 치료 개입의 연구는 이종 T 세포 집단 또는 복제에 의존하는 방법으로보다 빠른 속도로 진행할 수 있습니다당뇨병 NOD 생쥐에서 파생.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOD 마우스는 자발적으로자가 면역 당뇨병을 개발하고 널리 인간의 T1D 1,2에 대한 동물 모델로 사용되었습니다. NOD 생쥐에서 T1D의 발병 기전은 T와 B 세포에 의해 다음 수지상 세포와 대 식세포에 의한 랑게르한스의 췌장의, 나이, 3-4 주에 시작 침윤이 특징입니다. 비파괴 요정 인슐린 염이 단계는 3 세 ~ 6 개월 명백한 당뇨병의 결과로 인슐린 생산 췌장 β 세포의 느린 진보적 인 파괴에 이르게한다. 4,5 비장 세포, CD4 + 당뇨병 NOD 생쥐에서 6,7 또는 CD8 + 8,9 T 세포의 이동은 섬 반응 T 세포가 T1D 병인에 중요한 역할을한다는 것을 나타내는 면역 NOD 생쥐에서 당뇨병을 중재하기 위해 표시되었습니다. 실험 조건에 따라 당뇨병이 연구의 여러 주에 걸쳐 서서히받는 생쥐에서 개발했습니다. 마찬가지로, 다양한 T 세포 클론은 시간과 비용에 의해 파생diabetogenic T 세포의 배양은 몇 주받는 마우스 7,10로 전송 한 후 당뇨병을 중재하는 것으로보고되었다. CD4 또는 CD8 제한된 diabetogenic T 세포 클론, 여러 실험실에서 파생하는 TCR 표현 형질 전환 생쥐의 가용성이어서는 마우스에서 비장 T 세포가 11-13 사람에게 당뇨병을 전송 할 수 있었던 것으로 나타났습니다. 특히, BDC2.5 NOD 마우스는 chromogranin A, 췌장 베타 세포 14-16에서 단백질 특정 BDC2.5 TCR에 대한 형질 전환합니다. 체외 활성화 또는 효율성에게 11,17-19 다양한에서 신생아 나 면역 결핍 NOD 마우스로 당뇨병을 전송 공공연히 당뇨병 또는 prediabetic BDC2.5 생쥐 해제 활성화 또는 전부를 분별 비장 세포에서의 전송합니다.

우리는 정제 된 형질 전환 CD4를 사용하는 간단한 방법 + 높은 효율과 consiste에서받는 생쥐에서 T1D 유도하는 사전 당뇨병 BDC2.5 생쥐에서 T 세포를 설명NCY. 순진, 섬 항원 특이 CD4 + T 세포의 큰 숫자는 CD4에 대한 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 형질 전환 TCR Vβ4 체인을 표현 + CD62L + T 세포에 의해 이러한 생쥐에서 격리됩니다. 정제 된 유전자 변형 T 세포는 그 기능 T 및 B 세포의 부족과 인슐린 염 및 당뇨병 무료 20아르 NOD.SCID 마우스로 작동하지 않는 전송됩니다. 받는 마우스는 T 세포 전송 후 2 주 이내에 신속하게 개발 T1D를 나타내는 소변 포도당의 높은 농도를 모니터링합니다.

이종 특이성과 diabetogenic T 세포를 전송, 우리의 프로토콜은 FACS 정렬 된 CD4 + 거의 독점적으로 diabetogenic BDC2.5 TCR을 표현하는 T 세포를 사용하는 다른 방법과 달리. 자신의 동질성으로 인해, 전송 T 세포 (~ 1X10 6 세포 / 마우스) 만 작은 숫자가 100 % 발생에서 2 주 안에 신속하게 T1D 개발을 위해 필요합니다. 우리의 프로토콜의 또 다른 장점은 irradiatio입니다받는 생쥐의 N은 다른 방법입니다 필요하지 않습니다. 이 방법의 잠재적 인 제한은 모두 CD4와 CD8 T 세포의 하위 집합 또는 특정 당뇨병 CD8 T 세포의 공헌에 대해 조사를 허용하지 않는 것입니다.

설명 프로토콜은 대상 기관에 섬 항원 특이 목 세포의 유도에 개입 순진, monospecific CD4 + T 세포뿐만 아니라 치료 전략에 의해 중재 빠른 T1D 개발, 연구에 유용 할 것입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 비장과 BDC2.5 쥐의 림프절에서 T 세포의 분리

  1. diabetogenic CD4 + T 세포의 기증자로 6 주 된 사전 당뇨병 여성 BDC2.5 마우스를 사용합니다. 소변 포도당 측정 (아래 참조)에 의해 결정되는 마우스는 당뇨병이 없어야합니다.
  2. CO 2 질식을 사용하여 각 마우스를 안락사 및 무균 조건 하에서 비장, 겨드랑이 및 상완 림프절을 제거합니다. 비장을 제거하려면, 70 % 에탄올로 모피를 흡수 한 다음 잘라 피부를 철회. 비장은 마우스의 왼쪽에 어두운 붉은 기관으로 볼 수 있습니다. 작은 가위를 사용하여 복막의 1 인치 절개를 부드럽게 작은 핀셋 한 쌍의 중앙에 비장을 파악. 조심스럽게 결합 조직과 연결된 지방 최대한 트림과 비장을 제거합니다.
  3. 얼음에 15 ML 원뿔 튜브 10 ML Dulbecco's으로 수정 이글의 중간 (DMEM)에서 비장과 림프절을 수집합니다.
  4. 일을 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다부드럽게 70 μm의 셀 스트레이너 (여과기 당 하나의 비장과 스트레이너 당 4-6 림프절) 같은 50 ML 원뿔 튜브로를 통해 림프 기관을 누릅니다 멸균 10 ML의 주사기 플런저의 전자 끝.

이 과정에서, 스트레이너에서 세포의 회복을 최대화하기 위해 1 ML DMEM 여러 번 각 스트레이너 린스.

  1. RT에서 12 분 동안 300 ~ 400 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 50 ML 원뿔 튜브에서 수집 된 세포를 전송합니다.
  2. 적혈구를 용해하는, 상층 액을 버리고, 5 ML 암모늄 - 염화 칼륨 (ACK) 버퍼 (산도 7.2)에서 세포를 다시 일시 중지하고 5 분 RT에서 ACK 세포 현탁액을 품어.
  3. ACK 세포 현탁액에 DMEM 10 ML을 추가하고 위와 같이 튜브를 원심 분리기. 10 ML DMEM에 한 번 세포 펠렛을 씻으십시오.

2. Diabetogenic CD4의 형광 활성 세포 정렬 + BDC2.5 마우스에서 T 세포

  1. 5 ML 외과의에서 다시 일시 중지합니다 세포버퍼를 함유 성 및 판 블루 염색 배제하여 가능한 세포 (위상차 현미경과 혈구를 사용하여)의 수를 계산합니다.
  2. FACS 버퍼를 사용하여 5 × 10 7 세포 / ML에 세포 현탁액 볼륨을 조정합니다. ~ 제거 1 × 10 염색 제어 당 6 셀 (1 아무 얼룩, 3 단 얼룩). 비 활성화 된 유전자 변형 CD4 + 안티 CD4와 T 세포 (APC), 안티 TCR Vβ4 (FITC)와 15 ML 튜브에 반대로 CD62L (PE) 단일 클론 항체 (단클론 항체)에 대한 샘플을 얼룩. 어둠 속에서 4시에 20 ~ 30 분 동안 제조업체에서 권장하는 단클론 항체의 농도 ° C를 사용하여 세포 염색을 수행합니다.
  3. > 배 염색 반응 볼륨 FACS 버퍼와 샘플 및 단일 얼룩 컨트롤을 씻으십시오. (1-2 X 10 6 세포 / 샘플을 정렬 ML 300 μL 하나의 얼룩 컨트롤)과 얼음에 저장 다음까지 300 ~ 400 XG에서 튜브를 원심 분리, 상층 액을 제거하고 FACS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다 단계.
  4. 35 μm의 세포를 통해 세포 샘플을 전달스트레나 캡 튜브는 세포 덩어리를 제거합니다. CD4에 대한 샘플을 정렬 + TCR Vβ4 + CD62L + 훈련 연산자 세포 분류기의 셀. 15 ML 튜브에 3 ML DMEM으로 정렬 세포를 수집합니다. 2 × 10 총 4 개 이벤트 / 초의 정렬 속도 1.5 X 10 8 셀 (3 공여 생쥐에서 얻은 세포의 대략적인 개수) 정렬하려면, 설치 등 2.5-3 시간을 허용합니다. 기대 ~ 2.5 × 10 6 비 활성화 된 유전자 변형 CD4 + 세포 분류 한 후 마우스 당 T 세포.
  5. 정렬의 끝에 정렬 된 세포의 절대 수를 기록하고 300 ~ 400 X g에서 12 분을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 다시 중단 세포 (2 × 10 6 세포 / ㎖)의 멸균 인산 완충 입양 T 세포의 이동을위한 식염수 (PBS) (MG 2 + / 칼슘 2 + 무료).

3. BDC2.5 쥐에서 Diabetogenic CD4의 입양 전송 + T 세포

  1. 다시 일시 중지합니다 FACS - 정제 된 CD4 부드럽게, 1 ML의 주사기와 18-1 ½ 게이지 바늘을 사용하여 +1 ML의 주사기를 T 세포를로드합니다. 주입을위한 준비, 18-1를 교체 ½ 게이지 바늘을 27과 ½ 게이지 바늘을.
  2. 그들은 행동을 손질 전시 될 때까지 가열 램프 6-8 주 된 여성 NOD.SCID받는 쥐를 노출합니다.
  3. 고정 장치에서받는 생쥐을 억제하고 주사 부위를 소독 70 % (V / V) 에탄올로 자신의 꼬리를 닦아냅니다.
  4. 측면 꼬리 정맥 중 하나에 1-2 X 10 6 FACS 분류 세포 / 마우스 (최대 500 μL PBS)로 주입한다.

플런저를 강요하지 않습니다. 바늘이 정맥에 적절하게있는 경우, 주입 거의 저항 일어날 것입니다.

4. 고혈당에 대한받는 사람 쥐 모니터링 및 T1D

  1. T 세포 전송 후 5 일부터 NOD.SCID받는 마우스는 제조업체의 지침에 따라 시약 스트립을 (바이엘 Diastix)를 사용하여 높은 소변 포도당 동안 매일 모니터링됩니다. 두 개의 연속 urin와 마우스전자 포도당 수치가> 250 ㎎ / dl로는 당뇨병 간주됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 결과는 췌장 림프절로 차 림프 기관에 집 T 세포에 대한 중요한 CD62L을 표현 형질 전환 BDC2.5 세포의 분리를 보여줍니다. 우리의 연구 결과는 더 빠르게 전송하고 효율적으로 NOD.SCID받는 마우스에 T1D이 monospecific T 세포 인구의 강력한 기능을 보여줍니다.

diabetogenic CD4 + BDC2.5 생쥐에서 T 세포의 분리는 그림 2에 표시됩니다. 풀 비장과 림프절에서 약 5 × 10 7 세포는 세포 분류하기 전에 기증자 마우스를 당 하였다. 유세포 종류에 따라, ~ 2.5 × 10 6 순진 형질 전환 된 CD4 + T 세포 (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +)가 표시된 게이팅 전략을 사용하여 각 BDC2.5 기증자 마우스에서 얻은 하였다.

CD4의 작은 숫자의 예상 입양 전송 등 + TCR Vβ4 + CD6...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T1D은 당뇨병 NOD 마우스 또는 diabetogenic T 세포 클론에서 유래 TCR는 형질 전환 생쥐에서 전체 비장 세포 또는 T 세포 부분 집합의 입양 전송하여 효율성을 다양한에서받는 생쥐에서 유도 할 수 있습니다. 우리는 여기 NOD.SCID 생쥐에 FACS - 정제 CD62L + BDC2.5 형질 전환 된 CD4 + T 세포를 전송하여 100 % 발생에서 2 주 이내에받는 생쥐에서 T1D 유도하는 재생 방법을보고합니다.

BDC2.5 T 세포 이동 모델 별 장점은 자연 당뇨병 개월 및 최대 diabetogenic T 세포의 하위 집합 또는 T 세포 클론에 의한 당뇨병 전송을위한 몇 주에 비해 T1D의 매우 짧은 유도 시간을 포함 여기에 설명. 또한, 자신의 동질성으로 인해 BDC2.5 형질 전환 된 T 세포를 정화의 단지 작은 숫자는 높은 효율성과 일관성 T1D 전송해야합니다. 이전 TRA에 형질 전환 BDC2.5 T 세포의 생체 활성에 다른 T 세포...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 마우스는 펜 스테이트 기관 동물 관리의 지침에 따라 및 사용위원회 의과 특정 병원균이없는 (SPF) 시설의 펜실베니아 주립 대학에서 지내게되었다.

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 Drs에 감사드립니다. 도움이 덧글에 대한 로버트 BONNEAU 닐 크리스텐슨.

이 작품은 의학 자금의 펜실베니아 주립 대학에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BDC 2.5 TCR 형질전환 NOD 마우스(NOD. Cg-Tg(Tcr&알파; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)JAX004460
끄덕임. SCID 마우스(NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ThemoScientificSH30022.01
바이엘 DiastixFisher ScientificAM2803
15 ml 원뿔형 튜브Falcon352095
50 ml 원뿔형 튜브Falcon352070
멸균 수술용 핀셋
멸균 작은 쌍의 가위
70 μ m 세포 여과기Fisher Scientific22363548
35 μ m 세포 여과기 캡 튜브BD Biosciences352235
암모늄-염화물-칼륨(ACK) 버퍼0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O
BD FACSFlowTM 칼집 유체BD Biosciences342003
FACS 염색 완충액PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, 필터 멸균
위상차 현미경
Trypan 블루
혈구계
Anti-CD4 (APC)mAb Biolegend1005616클론 RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC)mAb BD Biosciences553365클론 KT4
Anti-CD62L (PE) mAbBD Biosciences553151클론 MEL-14
세포 분류기BD Biosciencese.g. BD FACSAria III
열 램프
마우스 억제
1ml 주사기Becton Dickinson309602
18-1½ 게이지 바늘 (sterile)Becton Dickinson305196
27½ 게이지 바늘 (sterile)Becton Dickinson305109
멸균 큰 쌍의 가위 기

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
  2. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
  3. Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
  4. Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
  5. Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
  6. Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
  7. Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
  8. Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
  9. Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
  10. Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
  11. Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
  12. Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
  13. Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
  14. Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
  15. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  16. Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
  17. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
  18. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
  19. Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
  20. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
  21. Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
  22. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
  23. Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
  24. Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

TCD4 TNOD SCIDBDC2 5

관련 논문