우리는 섬 항원 특정 기본 CD4 + T 세포의 입양 전송하여 두 주 이내에 생쥐에서 제 1 형 당뇨병 (T1D)를 유도하는 재생 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
nonobese 당뇨병 (NOD) 마우스 자발적 연령 12 주 후에 면역 당뇨병을 개발하고 인간 1 형 당뇨병 (T1D)의 가장 광범위하게 연구 동물 모델입니다. 조사받는 생쥐의 세포 이동 연구는 T 세포가이 모델 T1D 발병에 중요한 것을 설립했다. 우리는 빠르게 정화의 입양 전송에 T1D 유도하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명, 기본 CD4 + NOD.SCID받는 생쥐에 섬 특정 T 세포 수용체 (TCR) BDC2.5위한 형질 전환 전 당뇨병 NOD 생쥐에서 T 세포. 이 기술의 주요 장점은 같은 일 이내에, 수신자의 조사가 필요하지 않으며 T1D의 높은 발병률이 T 세포 전송 후 2 주 안에 이끌어됩니다 diabetogenic T 세포의 분리 및 입양 전송이 완료 될 수 있습니다. 따라서, T1D의 병인과 치료 개입의 연구는 이종 T 세포 집단 또는 복제에 의존하는 방법으로보다 빠른 속도로 진행할 수 있습니다당뇨병 NOD 생쥐에서 파생.
서론
NOD 마우스는 자발적으로자가 면역 당뇨병을 개발하고 널리 인간의 T1D 1,2에 대한 동물 모델로 사용되었습니다. NOD 생쥐에서 T1D의 발병 기전은 T와 B 세포에 의해 다음 수지상 세포와 대 식세포에 의한 랑게르한스의 췌장의, 나이, 3-4 주에 시작 침윤이 특징입니다. 비파괴 요정 인슐린 염이 단계는 3 세 ~ 6 개월 명백한 당뇨병의 결과로 인슐린 생산 췌장 β 세포의 느린 진보적 인 파괴에 이르게한다. 4,5 비장 세포, CD4 + 당뇨병 NOD 생쥐에서 6,7 또는 CD8 + 8,9 T 세포의 이동은 섬 반응 T 세포가 T1D 병인에 중요한 역할을한다는 것을 나타내는 면역 NOD 생쥐에서 당뇨병을 중재하기 위해 표시되었습니다. 실험 조건에 따라 당뇨병이 연구의 여러 주에 걸쳐 서서히받는 생쥐에서 개발했습니다. 마찬가지로, 다양한 T 세포 클론은 시간과 비용에 의해 파생diabetogenic T 세포의 배양은 몇 주받는 마우스 7,10로 전송 한 후 당뇨병을 중재하는 것으로보고되었다. CD4 또는 CD8 제한된 diabetogenic T 세포 클론, 여러 실험실에서 파생하는 TCR 표현 형질 전환 생쥐의 가용성이어서는 마우스에서 비장 T 세포가 11-1....
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프로토콜
1. 비장과 BDC2.5 쥐의 림프절에서 T 세포의 분리
- diabetogenic CD4 + T 세포의 기증자로 6 주 된 사전 당뇨병 여성 BDC2.5 마우스를 사용합니다. 소변 포도당 측정 (아래 참조)에 의해 결정되는 마우스는 당뇨병이 없어야합니다.
- CO 2 질식을 사용하여 각 마우스를 안락사 및 무균 조건 하에서 비장, 겨드랑이 및 상완 림프절을 제거합니다. 비장을 제거하려면, 70 % 에탄올로 모피를 흡수 한 다음 잘라 피부를 철회. 비장은 마우스의 왼쪽에 어두운 붉은 기관으로 볼 수 있습니다. 작은 가위를 사용하여 복막의 1 인치 절개를 부드럽게 작은 핀셋 한 쌍의 중앙에 비장을 파악. 조심스럽게 결합 조직과 연결된 지방 최대한 트림과 비장을 제거합니다.
- 얼음에 15 ML 원뿔 튜브 10 ML Dulbecco's으로 수정 이글의 중간 (DMEM)에서 비장과 림프절을 수집합니다.
- 일을 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다부드럽게 70 μm의 셀 스트레이너 (여과기 당 하나의 비장과 스트레이너 당 4-6 림프절) 같은 50 ML 원뿔 튜브로를 통해 림프 기관을 누릅니다 멸균 10 ML의 주사기 플런저의 전자 끝.
이 과정에....
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결과
우리의 결과는 췌장 림프절로 차 림프 기관에 집 T 세포에 대한 중요한 CD62L을 표현 형질 전환 BDC2.5 세포의 분리를 보여줍니다. 우리의 연구 결과는 더 빠르게 전송하고 효율적으로 NOD.SCID받는 마우스에 T1D이 monospecific T 세포 인구의 강력한 기능을 보여줍니다.
diabetogenic CD4 + BDC2.5 생쥐에서 T 세포의 분리는 그림 2에 표시됩니다. 풀 비장과 림프절에서 약 5 × 10 7 세포는 세포 분류하기 전에 기증자 마우스를 당 하였다. 유세포 종류에 따라, ~ 2.5 × 10 6 순진 형질 전환 된 CD4 + T 세포 (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +)가 표시된 게이팅 전략을 사용하여 각 BDC2.5 기증자 마우스에서 얻은 하였다.
CD4의 작은 숫자의 예상 입양 전송 등 + TCR Vβ4 + CD6.......
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토론
T1D은 당뇨병 NOD 마우스 또는 diabetogenic T 세포 클론에서 유래 TCR는 형질 전환 생쥐에서 전체 비장 세포 또는 T 세포 부분 집합의 입양 전송하여 효율성을 다양한에서받는 생쥐에서 유도 할 수 있습니다. 우리는 여기 NOD.SCID 생쥐에 FACS - 정제 CD62L + BDC2.5 형질 전환 된 CD4 + T 세포를 전송하여 100 % 발생에서 2 주 이내에받는 생쥐에서 T1D 유도하는 재생 방법을보고합니다.
BDC2.5 T 세포 이동 모델 별 장점은 자연 당뇨병 개월 및 최대 diabetogenic T 세포의 하위 집합 또는 T 세포 클론에 의한 당뇨병 전송을위한 몇 주에 비해 T1D의 매우 짧은 유도 시간을 포함 여기에 설명. 또한, 자신의 동질성으로 인해 BDC2.5 형질 전환 된 T 세포를 정화의 단지 작은 숫자는 높은 효율성과 일관성 T1D 전송해야합니다. 이전 TRA에 형질 전환 BDC2.5 T 세포의 생체 활성에 다른 T 세포.......
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공개 사항
모든 마우스는 펜 스테이트 기관 동물 관리의 지침에 따라 및 사용위원회 의과 특정 병원균이없는 (SPF) 시설의 펜실베니아 주립 대학에서 지내게되었다.
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 Drs에 감사드립니다. 도움이 덧글에 대한 로버트 BONNEAU 닐 크리스텐슨.
이 작품은 의학 자금의 펜실베니아 주립 대학에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BDC 2.5 TCR 형질전환 NOD 마우스(NOD. Cg-Tg(Tcr&알파; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| 끄덕임. SCID 마우스(NOD. CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Themo | Scientific | SH30022.01 | |
| 바이엘 Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml 원뿔형 튜브 | Falcon | 352095 | |
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Falcon | 352070 | |
| 멸균 수술용 핀셋 | |||
| 멸균 작은 쌍의 가위 | |||
| 70 μ m 세포 여과기 | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μ m 세포 여과기 캡 튜브 | BD Biosciences | 352235 | |
| 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 버퍼 | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM 칼집 유체 | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS 염색 완충액 | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, 필터 멸균 | ||
| 위상차 현미경 | |||
| Trypan 블루 | |||
| 혈구계 | |||
| Anti-CD4 (APC) | mAb Biolegend | 1005616 | 클론 RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ 4 (FITC) | mAb BD Biosciences | 553365 | 클론 KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | 클론 MEL-14 |
| 세포 분류기 | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| 열 램프 | |||
| 마우스 억제 | |||
| 1ml 주사기 | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ 게이지 바늘 (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ 게이지 바늘 (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
참고문헌
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011....
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